Содержание

Продукты красоты. Белок. Часть I. Мясо, рыба, икра.

И так, что нам нужно, что бы быть в тонусе, красивыми и здоровыми.
Во-первых для здоровья полезен белок, благодаря которому мы и ведем активный образ жизни, трудимся и развиваемся.

Давайте попробуем разобраться где же нам брать это ценное вещество, столь необходимое для нашего организма?

Мясо:
Ну, прежде всего мясо содержит белок животного происхождения, который полезен для здоровья наших мышц, связок и внутренних органов. Больше всего белка содержится в телятине и говядине. Мясо богато минеральными веществами – кальций, калий, магний, цинк, железо, медь. Витаминами A, В, D.
Но, мясо переваривается в желудке до 5 часов, а это действительно долго — оказывает сильную нагрузку на всю пищеварительную систему.


Рыба:
Белок, что содержится в рыбе, усваивается довольно быстро, максимум за 1,5 часа.
К тому же, рыба богата витаминами А, В1, В2, В6, В12, D, Е, РР (скумбрия, сельдь, сардина, судак, севрюга, тунец, палтус, горбуша и лосось).


Рыба богата Омега-3 жирными кислотами (сайра, сардина, севрюга, скумбрия, угорь, сельдь, мойва, килька).


Рыба содержит калий, кальций, железо, магний и фосфор, которые тоже легко усваиваются (горбуша, зубан, камбала, кета, минтай, палтус, сайра, севрюга, сардина, треска и тунец).

Икра:
Бесспорно икра по настоящему богата белком.
Кроме того она содержит витамины A, B, D, E. Кстати, витамина В12 в ней в гораздо больше, чем в мясе. Более того, икра содержит аминокислоты, микроэлементы, минеральные вещества, Омега 3 – улучшает работу мозга, кровообращение, снижает развитие тромбов, повышает иммунитет, улучшает зрение, препятствует развитию сердечно-сосудистых заболеваний, замедляет старение организма.

Больше есть икры рекомендуют мужчинам, для усиления их «мужской силы» и любовного влечения.
 Кроме того, частое употребление икры – выводит токсины и шлаки из организма.
Икра относится к полезным, низкокалорийным и легкоусвояемым продуктам — диетологи рекомендуют обязательно включать икру в свой рацион питания.
 Больше всего белка в красной икре и икре минтая.

Старайтесь разнообразить ваш рацион. В нем должны присутствовать и мясо, и рыба. А ваш организм сам возьмет только самое ценное и полезное.


Старайтесь чаще экспериментировать с гарнирами и основными блюдами. Добавлять икру в салаты и подавать в качестве отдельной закуски.


Помните, что совсем необязательно себя ограничивать или полностью отказываться от тех или иных продуктов — главное во всем соблюдать меру.

Продукты, в которых содержится большое количество белка

В одном яйце содержится около 6 грамм белка и всего 71 калория. Но сегодня героями нашей статьи станут другие "протеиновые" продукты.

Курятина

Куриное мясо — это простой и доступный способ получить свою порцию белка в день. Оно хорошо в любом виде и способно дополнить любое блюдо. Но это еще не все преимущества курицы. В 100 граммах этого диетического мяса содержится 22 грамма белка и 115 калорий. 


Индюшатина

Обычно мы позволяем себе этот вид птицы только по праздникам, а зря. Индюшка — прекрасная альтернатива курице. Вы можете испечь ее целиком и подавать вместе с салатом или использовать слайсы варенного филе в качестве начинки для сэндвича. Главное, что 100 грамм мяса = 20 грамм белка = 116 калорий.

Свинина

Если вы называете себя настоящим мясоедом, который не считают птицу мясом, тогда у нас для вас хорошие новости: в свинине еще больше белка (100 грамм мяса — 28 грамм белка), но и калорий больше — все 160. Но можно же хоть раз побаловать себя сочным шашлыком с запеченными овощами?

Читайте также: ИСТОЧНИК ЗДОРОВЬЯ: ВСЕ О ВИТАМИННЫХ ДОБАВКАХ

 


Тунец

Каким бы вы его не покупали: свежим, замороженным и даже законсервированным, тунец — это настоящий кладезь протеина. Если оперировать цифрами, то 100 грамм этой рыбы — это 28 грамм белка и 128 калорий. Вы можете потреблять его в виде суши, сэндвича или цельного куска.

Тилапия

Не фанат рыбы, но готовы пожертвовать своими предпочтениями ради блюда с минимумом калорий и максимумом белка? Тогда наш вам совет — попробуйте тилапию. У нее нежный, едва ощутимый рыбный привкус, зато 26 грамм белка и 129 калорий в стандартных 100 граммах. Рекомендуем запекать тилапию на пергаментной бумаге.


Креветки

Еще один прекрасный белковый морепродукт. Мы сейчас говорим о всего 120 калориях и аж 24 граммах белка на 100 грамм. А количество блюд, которые вы можете создать из креветок невозможно сосчитать!

Читайте также: 5 ИДЕЙ ДЛЯ ЗДОРОВОГО УЖИНА


Творог

Молочная продукция богата на белки, но отдельно хочется отметить творог. И все благодаря тому, что его 100 грамм равны 14 граммам белка и 81 калории. Вы можете печь с творогом полезные десерты, добавлять его в смузи или делать творожные массы с ванилином и сухофруктами. Вариантов множество!



Греческий йогурт

Мы и сами любим сладкие йогурты с кусочками фруктов, но для здоровья и фигуры нет ничего лучше, чем греческий йогурт. Итак, в 100 граммах содержится 12 грамм белка и всего 64 калории. Стоит ли нам приводить еще аргументы в его пользу?

Тофу

Вегетарианцы не зря ценят этот продукт из сои, который помогает им восстановить баланс белка в организме. Конечно, вам придется поглощать его в огромных количествах, ведь по сравнению с мясом, в нем меньше протеина, а именно 10 грамм (а еще 94 калории).


Эдамамэ

Если вы не знали, то эдамамэ — это молодые соевые бобы в стручках, сваренные в воде или приготовленные на пару. Найти их не так просто, но в специализированных магазинах для вегетарианцев и веганов стоит попытать удачу. И вот зачем: в 100 граммах эдамамэ содержится 12 грамм белка и 136 калорий.  

Источник фото: unsplash.com

Чем заменить мясо? Лучшая альтернатива с высоким содержанием белка

Сегодня отказ от мяса довольно распространенное явление. Обусловлено это как морально-этическими убеждениями, так и медицинскими рекомендациями. Но так, как мясо является одним из главных источников белка, и отказ от него может вызвать серьезные нарушения в функционировании жизненно важных системах организма, стоит задуматься об альтернативных мясу вариантах.

В большинстве случаев, мясо успешно заменяется другими продуктами животного происхождения. Например, богатым источником белка являются морепродукты и рыба. Белок рыбы и морепродуктов способен полностью заменить белок, получаемый с мясом. Более того, аминокислотный состав этих продуктов сбалансирован лучше, а за счет меньшего количества соединительных тканей белок, получаемый с рыбой и морепродуктами, усваивается быстрее белка, получаемого с мясом. Не стоит забывать и о яйцах птиц, кисломолочных изделиях. Они также хорошая и полезная альтернатива мясу.

Следующее, что может послужить заменой мяса – белки растительного происхождения. Они, как правило, содержатся в бобовых, крупах, орехах и грибах. Это одни из самых доступных и полноценных замен мясу. Правда, придерживаясь растительной белковой диеты, мы жертвуем привычным нам видом мяса и его консистенцией. Для некоторых категорий людей это дается сложно в виду морально-психологических установок. Но даже и для таких случаев, человечество придумало альтернативу – соевую клетчатку. Производимая из растений семейства бобовых, соевая клетчатка способна качественно заменить белок, получаемый с мясом животных и птицы.

Соевая клетчатка по своей биологической ценности близка к рыбе. Всего лишь в 100 граммах этого продукта содержатся суточные многих полезных соединений и веществ. А по сравнению с мясом, соевая клетчатка и вовсе выигрывает по многим показателям: содержит больше белка, меньше жиров — соответственно меньше холестерина. Кроме того, продукция, изготовленная из сои, по текстуре похожа мясо животных, что практически не вызывает психологического дискомфорта у тех людей, кто вынужден отказаться от мяса по медицинским показаниям.

В наши дни соевая клетчатка распространённый продукт и приобрести его можно, как в розницу, так и оптом. Более подробную информацию о закупках этой продукции можно найти, перейдя по ссылке https://partnermk.ru/product/protocell/.

На правах рекламы.

Что нужно знать о белках – Курская правда

Протеин – важный питательный элемент, который играет ключевую роль в функционировании нашего организма. Он предоставляет строительные элементы для тканей нашего тела и может сохраняться как топливо для него.


Для использования нашим телом белков они должны быть переработаны в более простую форму, называемую аминокислотами. Всего существует 20 аминокислот, из них 9 являются незаменимыми, то есть наш организм должен получать их извне и не может синтезировать сам. Иначе говоря, только 9 из 20 аминокислот человек не может воспроизводить. Следовательно, эти 9 аминокислот необходимо получать из питания или пищевых добавок. Обычно животный белок считают полноценным, то есть белком, содержащим все виды аминокислот.
Белки, содержащиеся в овощах, – неполные, так как в них не хватает одной-двух жизненно важных аминокислот. Хотя из этого не следует, что вы не можете получить достаточного количества качественного белка, придерживаясь вегетарианской диеты. Вам просто необходимо включать в свой рацион различные семена, орехи, чечевицу, бобы и качественные зерновые, такие как киноа, гречка и амарант.

Сколько нужно?

Рекомендуемая порция белка – 46-60 граммов в день. Точное количество зависит от вашего веса и уровня вашей активности. Физическая активность и физические нагрузки, а также увеличение мышечной массы потребуют увеличения белка в рационе.
Также рекомендации различаются для детей, которым нужны белки для роста и развития, для беременных и кормящих мам или в период восстановления после голодания или операции.
Важно помнить, что вес продукта не является весом белка в нём. Например, если вес куриной грудки составляет 145 г, это не значит, что в ней содержится столько же граммов белка. 140 г курицы содержит около 43 г белка, остальное в основном вода.
Различные источники белка содержат разное количество протеина, который может быть усвоен организмом. Так, например, в среднем спирулина и хлорелла содержат 75-80% белка, который способен усвоить организм. Жёлтый горох и рисовый протеин усваивается на 85-90%.
Кроме этого, нужно учитывать такие факторы, как аллергии и проблемы с пищеварением. Неважно, насколько «хорошим» считается белок, если ваш организм его не переваривает и приводит к газообразованию, вздутию живота и запорам.

Откуда брать?

Водоросли и спирулина. Спирулина является одним из лучших суперпродуктов. В ней содержится от 65 до 71% полноценного белка в его натуральном виде. Это больше, чем в каких-либо других непереработанных продуктах. И в отличие от других форм белка, протеин в спирулине на 85-95% усваивается нашим организмом. Поскольку в ней не содержится целлюлозы, организму легко её переработать. Аминокислоты, находящиеся в спирулине, поступают в организм сразу же после их приёма. Перед её употреблением убедитесь, что она из чистого водоёма, а не из общественных озер, где разрешено катание на лодках. Также спирулина не может служить основным источником белка в рационе, так как сложно употребить достаточное её количество, чтобы удовлетворить потребности организма в белке. Но она прекрасна в качестве добавки в здоровом рационе.
Семена конопли – 65% белка, содержащегося в конопле, приходится на белок эдестин, который легко переваривается, усваивается и перерабатывается человеческим организмом. Она также не вызывает аллергии. Конопля содержит 30% белка.
Миндаль имеет сильные противовоспалительные свойства, это прекрасный источник здоровых жиров, клетчатки и белка. Для более лёгкого переваривания замочите миндаль на ночь, а затем очистите перед употреблением. Орехи не являются полноценным белковым продуктом, так как не содержат в себе полный спектр аминокислот, но служат прекрасным дополнением к здоровой диете.
Семена чиа. Этот чудесный продукт является полноценным белком с умеренными противовоспалительными свойствами, легко перевариваемый и лёгкий в приготовлении. Чиа хороший источник кальция и фосфора, а также клетчатки и марганца. Пудинг из этих семян может стать прекрасным завтраком, который легко приготовить на бегу, или богатым протеинами перекусом.
Дикая рыба. Все нутрициологи (специалисты по здоровому питанию) согласятся, что рыба полезна, но не вся рыба одинакова. Её происхождение имеет большое значение.
Фермерская рыба
– то же самое, что и курица клеточного содержания. Такую рыбу не кормят натуральным кормом, она часто болеет и бедна Омега-3 жирными кислотами, может содержать антибиотики и диоксин. Если вы едите рыбу регулярно, покупайте дикую рыбу. Полезные жиры очень ценны для нашего организма.
Яйца от кур свободного выгула. Богатый источник тиамина, рибофлавина, пантотеновой кислоты (витамин В5), фолиевой кислоты, витамина В12, биотина, витаминов D и Е, фосфора. Яйца могут быть великолепной лёгкой едой, если курицы, снесшие их, питались полезным кормом, не содержались в клетках и паслись на улице. Целые яйца более питательны, чем просто яичный белок, так как желток содержит все витамины, минералы, антиоксиданты и Омега-3 жирные кислоты. Покупайте органические яйца.
Киноа (псевдозлак, являющийся полноценным белком) прекрасно на вкус и легко в приготовлении даже для новичков.
Гречка – ещё один полноценный вид белка, который может заменить киноа.
Чечевица – хороший источник аминокисот, здоровых углеводов и клетчатки, хотя и не является полноценным белком. Для полноценности правильно сочетать её с зерновыми. Такое блюдо надолго утолит голод, не перегружая ЖКТ, как отдельная большая порция бобовых.
Творог и греческий йогурт содержат мало сахара, достаточно белка и здоровых жиров. Выбирайте органические продукты, чтобы избежать гормонов, химикатов и скрытых антибиотиков.
Темпе готовят из ферментированной сои, это хороший источник чистого белка для вегетарианцев, если у них нет аллергии на сою. Убедитесь, что это органический продукт, а не генномодифицированный. Было доказано, что протеин сои сравним по перевариванию с молоком, мясом, рыбой и яйцами. По словам профессора психологии Техасского Христианского Университета Darryn Willoughby, «соевый протеин обладает антиоксидантными свойствами, что улучшает наше здоровье и защищает от рака. Скорее всего, это связано с присутствием изофлавоноидов, сапонинов, фитиновой кислоты и ингибитора протеазы (представителя противовирусных средств) в её составе. Избегайте употребления переработанного соевого мяса и не переедайте соевые продукты, чтобы не возникло аллергической реакции на нее.
Органическая курица. Курица чаще остальных продуктов употребляется людьми, чтобы восполнить недостаток белка в рационе. В ней содержатся все жизненно важные аминокислоты. Покупайте куриное мясо от кур, выросших на природе, которых разнообразно кормили и которые находились на солнце, а не в клетке. Такое мясо отличается по вкусу и оказывает другое влияние на организм.
Говядина травяного откорма содержит все необходимые аминокислоты. Она богата цинком и железом. Если вы едите мясо, покупайте его от животных, вскормленных травой, а не зерном. Оно чище, имеет лучший запах, безопаснее и содержит больше нутриентов.
Рисовый и гороховый протеин – их комбинация представляет собой один из лучших на вкус концентрированных белков, которые нам доступны. Этот продукт чист на 80-90%, гипоаллергенен, легко усваивается.
Сухой сывороточный белок – второй продукт, богатый протеином, изготовленный из молока (казеин – самый главный молочный белок). Его можно встретить в основном в порошках, заменяющих пищу, белковом порошке и в готовых напитках. Сыворотка содержит незаменимые аминокислоты, в частности, высокую долю аминокислот разветвлённой цепи (лейцин, изолейцин, валин) и глютамин (аминокислота, поддерживающая иммунитет). Покупайте органическую сыворотку, без гормонов и от животных, вскормленных травой.
Выбирая источники белка, ориентируйтесь на свои вкусовые предпочтения, обращайте внимание, откуда он, и следите за реакцией своего организма на него. Так, например, если у вас есть проблемы с ЖКТ, чечевица и бобовые могут быть слишком тяжёлыми для вас.
Каждый человек уникален. В то время как одни чувствуют себя прекрасно, употребляя белки растительного происхождения, другие могут себя прекрасно чувствовать, придерживаясь палеотической диеты (с высоким содержанием животного белка и низким количеством углеводов). Ваша обязанность – заботиться о своём теле и быть толерантными к тем, кто выбрал другой путь.

Инфо Поле » 6 продуктов, богатых коллагеном, которые заставят вашу кожу сиять

01 февраля 2020

Коллаген синтезируется в организме, но после определенного возраста этот процесс сильно замедляется. Вот почему уже после 20 лет так важно внести в свой рацион продукты, богатые структурным белком. Итак, что же стоит добавить в меню?

1. Бульон на кости

Один из самых распространенных источников коллагена — бульон, получившийся после отваривания птицы или говядины с мосолками. Впрочем, подойдет и любое другое мясо. Главное, чтобы было с костью. Приготовление такого бульона — дело не быстрое, зато результат получается не только вкусным, но и крайне полезным для кожи. Кстати, самым эффективным считается именно говяжий бульон. Рекомендованная суточная порция — 170 — 340 г.

2. Желатин

Как именно его использовать — дело ваше. Одинаково полезными, с точки зрения обогащения коллагеном, будет и фруктовое желе на десерт, и заливная рыба. Если все эти блюда вам не по вкусу, попробуйте просто добавить ложку желатина в любимый смузи.

3. Яйца

В яичном белке содержатся глицин и пролин — аминокислоты, способствующие производству коллагена. А в яичном желтке — и сам коллаген. Кроме того, в яйцах достаточно полезных жиров и витамина D, которые помогают строительству мышц и костей. Лучше всего употреблять этот продукт на завтрак и отдавать предпочтение яйцам, сваренным вкрутую. Норма — 2 яйца в день.

4. Лосось

К сожалению, список продуктов, богатых коллагеном не слишком длинный. В лососе этого белка уже нет. Зато есть цинк, который способствует синтезу коллагена. А еще омега-3, которая помогает увлажнять кожу изнутри, а значит заметно замедлять ее старение. Лосось рекомендуется есть по 115 — 140 г, дважды в неделю. Если не получается, то присмотритесь к орехам и грибам. Они тоже богаты цинком.

5. Зеленые листовые овощи

Это тоже не про коллаген, но про вещества, способствующие его синтезу. В зеленых овощах в частности содержится хлорофилл. Он активно участвует в производстве белка. Так что налегаем на водоросли, рукколу, капусту и зеленую фасоль. Для усиления эффекта заправляем овощи оливковым или кунжутным маслом — источниками витаминов А и К. Хотите сияющую кожу? Можете спокойно съедать по 2-3 чашки овощей в день.

6. Цитрусовые

Лимоны, апельсины или грейпфруты — не важно, какой фрукт вы выберите. Важно, что во всех цитрусовых есть витамин С, необходимый для производства коллагена. Он связывает аминокислоты, которые участвуют в образовании пролина. А пролин — это и есть предшественник необходимого для сияния кожи белка. Но будьте аккуратны, не стоит съедать больше 2 фруктов в день.

Гидролизованный коллаген. Отзывы покупателей на основе опроса

05.03.22 Ирина
Коллаген вашей фирмы мне подарила коллега биохимик, так как у меня уже возраст за 50, сказала, что нужно для здоровья. Результат есть, ничего не беспокой, волосы и ногти стали более здоровыми. Покупаю для себя, почти два года пользуюсь вашей фирмой. Все устраивает, другие производители не интересуют. 

05.03.22 Вероника:
Увидела вас у блогера. Занимаюсь спортом, нужно поддерживать связки. Брала и гель и порошок. Гель удобно брать с собой и он без привкуса. Порошок удобнее для дома, хорошо разводится, приемлемая цена.  Других производителей не пробовала. 

05.03.22 Ольга:
Узнала о вас из интернет сетей. Продукцию приобретаю в основном для себя. При выборе коллагена обращаю внимание на состав, который устроил в вашем коллагене. По вкусовым качествам всё понравилось, но только немного сладковатый. Другой фирмы коллаген не пробовала, ваш вполне устраивает.

*************

Если вы всерьез обеспокоены состоянием своей кожи, не стоит уповать только на продукты. Не забывайте, что немаловажную роль играет и ваш образ жизни. Курение, прямые солнечные лучи и рафинированный сахар способны свести на нет все ваши старания. Кроме того, стоит присмотреться и к готовому коллагену. Например, в нашем интернет-магазине можно купить коллаген в виде геля или порошка. “Иван-Поле” выпускает коллаген со вкусом грейпфрута или яблока. Его легко брать с собой на работу или учебу и получать свою порцию коллагена, не задумываясь о том, как и когда сварить говяжий бульон.

Выбирайте гидролизованный коллаген от производителя:

Размер человеческого протеома: ширина и глубина

Int J Anal Chem. 2016; 2016: 7436849.

Елена А. Пономаренко

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Екатерина V. Poverennaya

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Ekaterina V. ILGISONIS

Институт биомедицинской химии , Москва 119121, Россия

Михаил Александрович Пятницкий

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Артур Т.Kopylov

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Виктор Г. ЗДОДА

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Андрей В. Лисица

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Александр I Арчаков

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Институт биомедицинской химии, Москва 119121, Россия

Академический редактор: Франтишек Форе

Поступила в редакцию 18 января 2016 г.; Пересмотрено 11 апреля 2016 г .; Принято 19 апреля 2016 г.

Copyright © 2016 Елена Александровна Пономаренко и др.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

В этой работе обсуждаются биоинформатика и экспериментальные подходы к изучению протеома человека, совокупности белков, экспрессируемых в различных тканях и органах.Поскольку протеом человека не является статичным объектом, представляется необходимым оценить количество различных видов белков (протеоформ) и измерить количество копий одного и того же белка в конкретной ткани. Здесь предлагается метаанализ базы знаний neXtProt для теоретического предсказания количества различных протеоформ, возникающих в результате альтернативного сплайсинга (AS), полиморфизмов отдельных аминокислот (SAP) и посттрансляционных модификаций (PTM). Рассматриваются три возможных случая: (1) ПТМ и САП появляются исключительно в канонических последовательностях белков, но не в сплайс-вариантах; (2) PTM и SAP могут встречаться как в белках, кодируемых каноническими последовательностями, так и в сплайс-вариантах; (3) все типы модификаций (AS, SAP и PTM) происходят как независимые события.Экспериментальная проверка протеоформ ограничена аналитической чувствительностью протеомной технологии. Для белков, кодируемых одной хромосомой, была построена колоколообразная гистограмма распределения с оценкой количества копий в плазме, печени и клеточной линии HepG2. Предлагаемые метабиоинформатические подходы могут быть использованы для оценки количества различных протеоформ для любой группы белок-кодирующих генов.

1. От генома человека к протеому человека

Секвенирование генома [1] расшифровало количество кодирующих белок генов, установив первоначальную оценку сложности, связанной с молекулярной биологией человека.Следующим шагом является получение аналогичных тестов на уровне протеома. В двух недавних статьях описано создание проекта протеома человека [2, 3]. Тем не менее еще требуются значительные усилия для изучения пространства (или размера) протеома человека как обязательной совокупности молекулярных профилей различных тканей и органов. Протеом человека — достаточно динамичная сущность [4], и это свойство следует рассматривать в двух измерениях. Во-первых, оценить количество различных типов белков (ширина протеома), а также измерить количество копий белка в конкретных тканях (глубина протеома).

Согласно гипотезе «один ген = один белок», должно быть не менее ~20 000 немодифицированных (канонических) белков человека. С учетом продуктов альтернативного сплайсинга (АС), продуктов, содержащих одноаминокислотные полиморфизмы (SAP), возникающие из несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (nsSNP), и продуктов, подвергающихся ПТМ [4, 5], потенциально могут быть до 100 различных белков. производиться из одного гена. Из множества различных терминов, предложенных для описания вариантов белков [6], здесь мы выбрали «виды белков» [7] или «протеоформы» [6].

Экспериментальная проверка видов белков ограничена аналитической чувствительностью протеомной технологии. Это означает, что чувствительность технологии определяет способность обнаруживать редкие виды белков. Это ограничение проистекает из основного различия между геномикой и протеомикой [8]. Геномика опирается на ПЦР [9] для амплификации молекул ДНК или РНК в биологическом образце до концентраций выше порога обнаружения. Однако в настоящее время не существует сопоставимой высокопроизводительной технологии, способной размножать копии одного белка [8].

100% охват белковой последовательности с использованием восходящей МС недостижим; таким образом, невозможно обнаружить все потенциальные виды белков, экспрессируемых одним и тем же геном. Как правило, исследования протеома сосредоточены на основных белках , напоминающих по крайней мере одну из многих возможных протеоформ, кодируемых геном и содержащих по крайней мере один протеотипический пептид, обнаруживаемый с помощью МС. Последовательность может быть модифицирована или немодифицирована, так что это означает, что главный белок может присутствовать как один белок или как набор белков. Мастер-протеом отдельной хромосомы является результатом идентификации и измерения всех мастер-белков, кодируемых хромосомой и экспрессируемых в выбранном типе биологического материала. Для экспериментальной проверки протеоформ необходимо провести целевой МС-анализ, чтобы исследовать изменение последовательности-кандидата. Предполагалось, что биоинформатический анализ разнообразия видов белков создаст основу для будущих экспериментальных исследований протеомного пространства.

2. Сколько различных белков необходимо для поддержания жизнедеятельности человека?

Количество различных белков, составляющих протеом человека, является ключевым вопросом протеомики. Исследователи предлагают цифры от 10 000 [10] до нескольких миллиардов [6] различных видов белков. Здесь мы описываем теоретический прогноз количества различных протеоформ, которые могут возникнуть в результате событий AS, SAP или PTM.

Данные были получены из neXtProt, который содержит только белки человека, их модификации и особенности последовательности [11].Аннотации neXtProt для AS, SAP и PTM возникли в результате биокурации данных из репозиториев, литературы и инструментов прогнозирования. Информация о возможной изменчивости белковой последовательности представлена ​​в виде количества вариантов AS, nsSNP/SAP и PTM на ген.

Мы исходили из того, что расширение базы данных и аннотирование являются составляющими процессами, скорость которых в основном ограничена количеством исследователей и аннотаторов по всему миру. Скорость слабо зависит от пропускной способности канала связи и доступности информации, так как они не слишком сильно менялись в течение 10–15 лет для нужд пользователей PubMed или UniProt.Следовательно, на увеличение количества аннотаций в определенной базе данных, как правило, будут влиять технологические достижения, полученные за счет повышения чувствительности/производительности биоаналитического метода.

Исходя из вышеизложенного, мы предположили, что объем репрезентативных данных, ежегодно загружаемых в UniProt [12] с 2005 г., достаточен для расчета среднего количества вариантов белка на один ген и числа для каждого типа вариации. Интересно, что с 2010 г. среднее количество модификаций на один ген практически не изменилось, несмотря на постоянное увеличение числа рассмотренных аннотаций.Среднее количество модификаций, в частности, со стороны AS (40% просмотренных аннотаций из всех записей данных), SAP (60% просмотренных аннотаций) или PTM (37%), практически не изменилось.

Насыщение числа аннотаций для геном-зависимых SAP, транскрипционно-зависимых AS и посттрансляционно-зависимых PTM весьма примечательно. В то время как определение PTM зависит от чувствительности анализа белков, обнаружение SAP и AS практически не имеет ограничений по чувствительности и активно накапливается в рамках крупномасштабных проектов [13].Несмотря на такие различия, все технологии синхронно приобрели уровни насыщения, что указывает на баланс между данными, полученными с использованием стандартных методов белковой химии (накопленными за последние 50 лет), и данными, полученными с помощью высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS).

Для оценки потенциального количества белков были рассмотрены три различных случая сочетания событий ПТМ, САП и АС (см. (1)–(3)). Комбинаторные вариации не учитывались, так как нет систематических экспериментальных данных, описывающих совместное появление различных типов модификаций в белковых видах.Это лишь один из возможных путей решения проблемы оценки потенциального числа белков на основе уже накопленных в постгеномных базах знаний данных о белковой дисперсии. Уравнение (1) предполагает, что PTM появляются исключительно в канонических последовательностях белков, но не в вариантах сплайсинга. Уравнение (2) предполагает, что PTM и SAP могут встречаться как в белках, кодируемых каноническими последовательностями, так и в вариантах сплайсинга. Уравнение (3) предполагает, что все типы модификации (AS, SAP и PTM) возникают независимо.Следовательно,

Nps=N*ASav+SAPav+PTMav,

(1)

Nps=N+AS*SAPav+PTMav,

(2)

Nps=N*ASav*002 90PTM03 (3)

, где Nps представляет собой количество видов белка, N представляет собой общее количество генов, кодирующих белок, AS — количество видов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, ASav — среднее количество вариантов сплайсинга на один ген, кодирующий белок. , SAPav — среднее количество nsSNP, а PTMav — среднее количество событий PTM на один ген, кодирующий белок.

Как правило, САП предопределены на уровне ДНК, АС возникает в результате модификаций на уровне мРНК, тогда как ПТМ возникают на уровне белка. Эти три процесса нельзя рассматривать как независимые события, учитывая, что между процессами генной экспрессии, транскрипции и трансляции существует внутренняя связь, направленная на регуляцию и сохранение клетки. Кроме того, обогащение поиска MS/MS через базу данных, содержащую все возможные комбинации вариаций белков, привело бы к комбинаторному коллапсу, несмотря на тип используемого подхода [14].

Поиск модификаций АС белка с помощью neXtProt (версия 2015_06) выявил 21 921 вариант АС в 10 519 кодирующих белок генах (2,1 ± 0,1 варианта на ген, включая одну каноническую последовательность). Наибольшее количество модифицированных форм (434 398, без элементов, связанных с раком, полученных из базы данных раковых мутаций COSMIC [15]) было связано с появлением SAP, полученных из nsSNP в 18 986 белок-кодирующих генах (22,1 ± 3,9 вариантов/ген). PTM добавили 6,6 ± 0,8 модифицированных белков на ген (94 036 PTM в 14 006 кодирующих белок генов).Применяя эти числа к уравнениям ( N = 20 043), мы оцениваем, что в организме человека существует 0,62, или 0,88, или 6,13 миллиона видов белков.

Приведенные выше результаты были сопоставлены с данными о вариациях, происходящих от AS и SAP, полученных из наших результатов NGS по профилированию транскриптома ткани печени [16–18]. По результатам NGS среднее число обнаруженных сплайс-вариантов составило 1,3 на белок-кодирующий ген (или 2,3 на ген, включая канонический вариант), что сопоставимо с данными neXtProt.Среднее количество САП-содержащих протеоформ составило ~1,4 на один ген, что значительно ниже рассчитанного по данным neXtProt. Эти различия связаны с тем, что neXtProt предоставляет информацию из множества различных экспериментов («совокупная человеческая популяция»), в то время как конкретные данные NGS указывают события SAP для отдельного образца или ткани (индивидуальные отклонения).

По мере того, как базы протеомных знаний объединяют информацию об изменчивости белков в человеческой популяции, несколько миллионов различных белков в конечном итоге заполнят «агрегированный» человеческий протеом.Чтобы расшифровать изменчивость, присущую предсказанию пространства протеома для человека, можно добиться более точной оценки количества белков, содержащих AS и SAP, с использованием результатов профилирования транскриптома конкретных образцов тканей.

3. Сколько белков можно обнаружить сегодня?

Согласно базе данных Plasma Proteome Database (ver. 06_2015) [19], обнаружено 10,5 тыс. белков плазмы крови и менее 10% (1278 из 20 043 белков человека) измерено количественно.Основной проблемой, касающейся экспериментальной проверки существующих наборов теоретически предсказанных белков, является предел аналитической чувствительности протеомной технологии. Аналитическая чувствительность определяется пределом обнаружения, зависящим от прибора, и динамическими диапазонами концентрации белка, зависящими от биоматериала. Плазма крови представляет собой сложную смесь с динамическим диапазоном концентраций белка, меняющимся более чем на 10 порядков [20], в то время как диапазон концентраций белка тканей или клеточных линий находится в пределах семи порядков [21].Задача состоит в обнаружении низко- и сверхнизкочисленных видов с концентрациями <10 90 105 −12 90 106  M в присутствии высококопийных белковых молекул при концентрациях >10 90 105 −6 90 106  M [22].

Принимая во внимание сверхчувствительные возможности олигонуклеотидной аналитики, поучительно учитывать, что результаты исследования транскриптома часто определяются на основе копий молекул РНК, а не их концентраций [23]. Работа при низких (<10 -12 мкМ) и сверхнизких (<10 -15 мкМ) концентрациях белков означает, что количественная оценка белка в количестве копий, а не в единицах концентрации, позволяет сравнивать транскриптомные и протеомные результаты [24].

Белки обычно количественно определяют в протеомике [25] по концентрации в биологическом образце, C , выраженной в моль/л (молярность, М). Соответствующее количество копий белка, N , в 1 л можно рассчитать из единиц концентрации следующим образом:

, где R A представляет собой обратное число Авогадро, 10 −24  M [26], V представляет собой объем пробы, м представляет собой содержание белка, а M w представляет собой молекулярную массу белка.

Формулы (4) решают главную задачу протеомики: перейти от представления о единицах концентрации к подсчету одиночных биомакромолекул в образце (ткани) [27].

Тройной квадрупольный масс-спектрометр позволяет достичь чувствительности 10 −14  M [28, 29] для белков-мишеней [30]. Чувствительность определения белков SRM может быть дополнительно увеличена до 10 90 105 −16 90 106  M за счет необратимого химического связывания белков из больших объемов биологических образцов [31] (не предполагается, что все измеренные белки были определены с такой чувствительностью; результаты измерения могут различаться на несколько порядков из-за различных физико-химических свойств протеотипических пептидов).

В контексте ширины протеома целевой подход ограничен необходимостью измерения только протеоформ, демонстрирующих априорное предположение о протеотипических пептидах, которые правильно напоминают события PTM, SAP или AS. В отличие от MS дробовика, SRM не может обнаруживать новые, неожиданные виды белков [32]. Возможности подходов МС «сверху вниз» и «снизу вверх» для решения проблемы микрогетерогенности протеома человека были описаны ранее [33]. Целевой SRM легко доступен для обнаружения SAP в связи с заболеваниями, включая ожирение/диабет [34] и рак [35].Например, метод SRM/MRM был применен для измерения количества сплайс-форм: три изоформы трансформирующего фактора роста были измерены с помощью SRM на уровне концентрации 10 90 105 -11 90 106  M в плазме мыши и слюне человека [36]. Другой пример, изоформы остеопонтина, были измерены с помощью анализа SRM и показали, что уровень изоформы был значительно выше для немелкоклеточной карциномы легкого по сравнению с контрольной группой (7 10 -10 по сравнению с 30 10 ). −10  M) [37].Применение направленной МС для обнаружения ПТМ было проиллюстрировано гликозилированием белков: N-гликозиды были обнаружены в плазме человека с уровнем чувствительности 10 90 105 -11 90 106 мкМ [38] и убиквитинированием [39]. Из этих экспериментальных исследований следует, что подавляющее большинство предсказуемых протеоформ, по-видимому, присутствует в концентрациях ниже предела обнаружения. Дальнейшее повышение чувствительности аналитических методов важно для выявления диагностически значимых протеоформ в биообразцах человека.

Поскольку было показано, что набор белков, кодируемых любой хромосомой человека, составляет репрезентативную часть всего протеома человека [40], виды белков с высокой, средней и низкой копийностью могут быть оценены путем отбора образцов мастер-белков, кодируемых единая хромосома. В качестве примера протеомной карты, ориентированной на хромосомы, мы загрузили данные из PASSEL [41] (идентификаторы PASSEL: PASS00278, PASS00276, PASS00092 и PASS00742), полученные для мастер-белков, кодируемых хромосомой 18 [16, 17]. Эти белки измеряли в трех типах биоматериала, включая плазму человека, образцы печени и клетки HepG2.Измерения проводились в соответствии с рекомендациями уровня 3 (исследовательские исследования) [42] с использованием стратегии двойной цели, которая сочетает в себе хромосомно-центрический подход с масс-спектрометрией SRM «снизу вверх» [43].

Наблюдалась колоколообразная гистограмма распределения основных белков, кодируемых хромосомой 18 (), показывающая медиану 10 8 копий на 1  мк л плазмы крови и 10 5 копий на печень/клетку HepG2. Восходящий участок кривой отражает высоко- и среднекопийные белки, тогда как нисходящий участок может быть объяснен либо уменьшением протеомного разнообразия в биологическом образце, либо, что более вероятно, представлением о том, что белки не могут быть обнаружены из-за низкой чувствительности аналитических методов. [44].Интересно, что после повышения чувствительности аналитического метода с 10 90 105 -14 90 106 мкМ до 10 90 105 -18 90 106 мкМ за счет необратимого связывания аналитов [30] было обнаружено 14 дополнительных низкокопийных видов белков (<10 90 105 5 90 106 копий на клетку или на 1  мкл л плазмы крови) были получены и количественно измерены не менее двух протеотипических пептидов в каждом виде биоматериала (см. заштрихованные области на рис.). Согласно полученным результатам, в плазме значительно больше видов белков с высоким содержанием по сравнению с клетками печени или HepG2.Поэтому вполне вероятно, что трудность идентификации ультранизкокопийных белков в плазме связана с высоким динамическим диапазоном концентраций белков плазмы [22].

(а) Распределение числа копий мастер-белков хромосомы 18, нормализованное на одну клетку HepG2/печени или 1  мк л плазмы. (б) Доля в зависимости от обнаруженных белков (в % от общего числа белков, кодируемых хромосомой 18) и аналитической чувствительности.

Для демонстрации глубины протеома количество копий мастер-белка в биообразце строили в зависимости от чувствительности протеомной технологии ().Покрытие протеома выражали в процентах доли обнаруженных белков от общего числа генов хромосомы 18, которое по данным neXtProt составило 276. Как показано на рисунке, кривая распределения белков плазмы смещается влево относительно кривых для клеток. Общее количество обнаруженных видов белков в клетках печени и HepG2 увеличилось по сравнению с плазмой крови человека.

Будущие успехи в исследовании протеома человека зависят от способности использовать методы биоинформатики для выяснения существующих видов белков и целевого МС-анализа, высокопроизводительных измерений и высокопроизводительных алгоритмов для de novo сборки белковых последовательностей на основе результатов МС.Кроме того, повышение чувствительности аналитической технологии обеспечит более широкий доступ к сверхнизкокопируемым белкам и расширит возможности для обнаружения и анализа. В этом контексте теоретическое предсказание количества протеоформ (оценка ширины протеома) и их распределения по динамическому диапазону (т. е. глубины протеома) в конечном итоге требуется для планирования рабочей нагрузки для проекта протеома человека, ориентированного на хромосомы.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке RSF Grant no.15-15-30041.

Сокращения

AS: Альтернативные сращивания
NGS:
NGS:
NGS: Секселирование следующего поколения
NSSNPS: Nossynynymous однонуклеотидные полиморфизмы
SAP: Одиночная аминокислота полиморфизм.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Ссылки

1. Коллинз Ф.С., Ландер Э.С., Роджерс Дж., Уотерстон Р.Х. Завершение эухроматической последовательности генома человека. Природа . 2005; 50: 162–168. [Google Академия]2. Вильгельм М., Шлегл Дж., Хане Х. и др. Проект протеома человека на основе масс-спектрометрии. Природа . 2014;509(7502):582–587. doi: 10.1038/nature13319. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Karlsson C., Malmström L., Aebersold R., Malmström J. Избранные для всего протеома анализы мониторинга реакции на человеческий патоген Streptococcus pyogenes . Связь с природой . 2012;3, статья 1301 doi: 10.1038/ncomms2297. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Рот М.Дж., Форбс А.Дж., Бойн М.Т., И.И., Ким Ю.-Б., Робинсон Д.Е., Келлехер Н.Л. Точная и параллельная характеристика кодирующих полиморфизмов, альтернативного сплайсинга и модификаций белков человека с помощью масс-спектрометрии. Молекулярная и клеточная протеомика . 2005;4(7):1002–1008. doi: 10.1074/mcp.M500064-MCP200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Юнгблут П., Тиеде Б., Зимни-Арндт У. и др. Разрешающая способность двумерного электрофореза и идентификация белков из гелей. Электрофорез . 1996;17(5):839–847. doi: 10.1002/elps.1150170505. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Арчаков А., Згода В., Копылов А. и др. Хромосомоцентрический подход к преодолению узких мест в проекте «Протеом человека». Экспертиза протеомики . 2012;9(6):667–676. doi: 10.1586/epr.12.54. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9.Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С. и др. Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Наука . 1988;239(4839):487–491. doi: 10.1126/science.2448875. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Адкинс Дж. Н. На пути к протеому сыворотки крови человека: анализ с помощью многомерного разделения в сочетании с масс-спектрометрией. Молекулярная и клеточная протеомика . 2002; 1: 947–955. doi: 10.1074/mcp.m200066-mcp200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11.Лейн Л., Аргуд-Пюи Г., Британ А. и др. NeXtProt: платформа знаний о белках человека. Исследование нуклеиновых кислот . 2012;40(1):D76–D83. doi: 10.1093/nar/gkr1179. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Abecasis G.R., Auton A., Brooks L.D., et al. Интегрированная карта генетических вариаций из 1092 геномов человека. Природа . 2012; 491:56–65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]14. Коттрелл Дж. С. Идентификация белков с использованием данных МС/МС. Журнал протеомики .2011;74(10):1842–1851. doi: 10.1016/j.jprot.2011.05.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Forbes S.A., Beare D., Gunasekaran P., et al. COSMIC: изучение мировых знаний о соматических мутациях при раке человека. Исследование нуклеиновых кислот . 2015;43(1):D805–D811. doi: 10.1093/nar/gku1075. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Згода В. Г., Копылов А. Т., Тихонова О. В. и др. Профилирование транскриптома хромосомы 18 и целевое картирование протеома в истощенной плазме, ткани печени и клетках HepG2. Журнал исследований протеома . 2013;12(1):123–134. doi: 10.1021/pr300821n. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Пономаренко Е. А., Копылов А. Т., Лисица А. В. и др. Транскриптопротеом хромосомы 18 ткани печени и клеток HepG2 и целевое картирование протеома в обедненной плазме: обновление 2013 г. Journal of Proteome Research . 2014;13(1):183–190. doi: 10.1021/pr400883x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Тяхт А. В., Ильина Е. Н., Алексеев Д. Г. и др. Профилирование экспрессии генов RNA-Seq в клетках HepG2: влияние экспериментальных факторов и сравнение с тканью печени. BMC Genomics . 2014;15, статья 1108 doi: 10.1186/1471-2164-15-1108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Мутусами Б., Хануманту Г., Суреш С. и др. База данных протеома плазмы как ресурс для протеомных исследований. Протеомика . 2005;5(13):3531–3536. doi: 10.1002/pmic.200401335. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Андерсон Н.Л., Полански М., Пипер Р. и соавт. Протеом плазмы человека. Молекулярная и клеточная протеомика . 2004;3(4):311–326.doi: 10.1074/mcp.m300127-mcp200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Бек М., Шмидт А., Мальмстрём Дж. и др. Количественный протеом клеточной линии человека. Молекулярно-системная биология . 2011;7, статья 549 doi: 10.1038/msb.2011.82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Андерсон Н. Л., Андерсон Н. Г. Протеом плазмы человека: история, характер и перспективы диагностики. Молекулярная и клеточная протеомика . 2002;1(11):845–867. doi: 10.1074/mcp.р200007-мкп200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Де Соуза Абреу Р., Пенальва Л. О., Маркотт Э. М., Фогель К. Глобальные признаки уровней экспрессии белков и мРНК. Молекулярные биосистемы . 2009;5(12):1512–1526. doi: 10.1039/b908315d. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Шванхойссер Б., Буссе Д., Ли Н. и др. Глобальная количественная оценка контроля экспрессии генов млекопитающих. Природа . 2011;473(7347):337–342. doi: 10.1038/nature10098. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25.Андерсон Н.Л., Андерсон Н.Г., Пирсон Т.В. и соавт. Проект обнаружения и количественного определения протеома человека. Молекулярная и клеточная протеомика . 2009;8(5):883–886. doi: 10.1074/mcp.R800015-MCP200. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Арчаков А. И., Иванов Ю. Д., Лисица А. В., Згода В. Г. Нанотехнология АСМ-рыболовства — способ обращения числа Авогадро в протеомике. Протеомика . 2007;7(1):4–9. doi: 10.1002/pmic.200600467. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27.Лисица А. В. Молярная концентрация приветствует авогадро в постгеномной аналитике. Биохимия и аналитическая биохимия . 2015;04:4–7. doi: 10.4172/2161-1009.1000216. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 28. Киёнами Р., Шон А., Пракаш А. и др. Повышенная селективность, аналитическая точность и производительность в целевой протеомике. Молекулярная и клеточная протеомика . 2011; 10(2) doi: 10.1074/mcp.M110.002931. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]29. Сано С., Тагами С., Хашимото Ю. и др. Абсолютное количественное определение пептидов APL1 β в плазме с низким содержанием на уровне субфмоль/мл с помощью SRM/MRM без иммуноаффинного обогащения. Журнал исследований протеома . 2014;13(2):1012–1020. doi: 10.1021/pr4010103. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Копылов А. Т., Згода В. Г., Лисица А. В., Арчаков А. И. Совместное использование технологии необратимого связывания и MRM для обнаружения и количественного определения низко- и сверхнизкокопийных белков. Протеомика .2013;13(5):727–742. doi: 10.1002/pmic.201100460. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Арчаков А., Иванов Ю., Лисица А., Згода В. Биоспецифический необратимый фишинг в сочетании с атомно-силовой микроскопией для обнаружения крайне малочисленных белков. Протеомика . 2009;9(5):1326–1343. doi: 10.1002/pmic.200800598. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Оливейра А.П., Людвиг К., Пикотти П., Когадеева М., Эберсолд Р., Зауэр У. Регуляция центрального метаболизма дрожжей путем фосфорилирования ферментов. Молекулярно-системная биология . 2012;8, статья 623 doi: 10.1038/msb.2012.55. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Лисица А., Мошковский С., Чернобровкин А., Пономаренко Е., Арчаков А. Профилирование протеоформ: перспективное развитие протеомики для открытия биомаркеров. Экспертиза протеомики . 2014;11(1):121–129. doi: 10.1586/14789450.2014.878652. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Су З.-Д., Сунь Л., Ю Д.-Х. и др. Количественное обнаружение полиморфизмов отдельных аминокислот с помощью целевой протеомики. Журнал молекулярной клеточной биологии . 2011;3(5):309–315. doi: 10.1093/jmcb/mjr024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Ван К., Чаркади Р., Ву Дж. и др. Мутантные белки как канцерспецифические биомаркеры. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 2011;108(6):2444–2449. doi: 10.1073/pnas.1019203108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]36. Лю С., Джин З., О’Брайен Р. и др. Ограниченный мониторинг избранных реакций: количественная оценка выбранных посттрансляционных модификаций и изоформ белков. Методы . 2013;61(3):304–312. doi: 10.1016/j.ymeth.2013.03.006. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]37. Ву Дж., Пунгалия П., Крайнов Э., Бейтс Б. Идентификация и количественная оценка вариантов сплайсинга остеопонтина в плазме больных раком легкого с использованием иммуноаффинного захвата и целевой масс-спектрометрии. Биомаркеры . 2012;17(2):125–133. doi: 10.3109/1354750X.2011.643485. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Оссола Р., Шисс Р., Пикотти П., Риннер О., Reiter R., Aebersold R. Валидация биомаркеров в образцах крови с помощью масс-спектрометрии мониторинга выбранных реакций N-гликозитов. Методы молекулярной биологии . 2011; 728:179–194. [PubMed] [Google Scholar] 39. Кеттенбах А. Н., Раш Дж., Гербер С. А. Абсолютная количественная оценка белка и количества посттрансляционных модификаций с помощью синтетических пептидов, меченных стабильными изотопами. Природные протоколы . 2011;6(2):175–186. doi: 10.1038/nprot.2010.196. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40.Пономаренко Е., Поверенная Е., Пятницкий М. и др. Сравнительное ранжирование хромосом человека на основе постгеномных данных. OMICS: Журнал интегративной биологии . 2012;16(11):604–611. doi: 10.1089/omi.2012.0034. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Кузебаух У., Дойч Э.В., Кэмпбелл Д.С., Сан З., Фарра Т., Мориц Р.Л. Использование PeptideAtlas, SRMAtlas и PASSEL: комплексные ресурсы для обнаружения и целевой протеомики. Текущие протоколы в биоинформатике .2014; 46:1–28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]42. Карр С.А., Аббатиелло С.Е., Акерманн Б.Л. и др. Целевые измерения пептидов в биологии и медицине: передовой опыт разработки методов анализа на основе масс-спектрометрии с использованием целевого подхода. Молекулярная и клеточная протеомика . 2014;13(3):907–917. doi: 10.1074/mcp.m113.036095. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Арчаков А., Асеев А., Быков В. и др. Геноцентрический взгляд на проект протеома человека: на примере российской дорожной карты по хромосоме 18. Протеомика . 2011;11(10):1853–1856. doi: 10.1002/pmic.201000540. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Лисица А. В., Поверенная Е. В., Пономаренко Е. А., Арчаков А. И. Ширина протеома плазмы человека в сравнении с раковой клеточной линией и бактериями. Биомолекулярные исследования и терапия . 2015;4, статья 132 doi: 10.4172/2167-7956.1000132. [CrossRef] [Google Scholar]

белков и экспрессия генов | Изучайте науку в Scitable

С точки зрения клеточной биологии изучение экспрессии генов тесно связано с нашим пониманием белков.Начиная с ранних работ Кристиана Анфинсена в 1950-х годах мы знаем, что последовательность аминокислот в белке определяет его окончательную трехмерную структуру. Исходя из этого, ученые неоднократно наблюдали, что структура белка диктует, где он будет действовать и что он будет делать. Нигде это не было более очевидным, чем с функцией ферментов. Форма и структура белков являются важнейшим аспектом биологии экспрессии генов и связывают наше понимание экспрессии генов с биологией клетки.Хотя в первую очередь речь идет о белковых молекулах, которые действуют на последовательности ДНК и РНК, таких как факторы транскрипции и гистоны, изучение экспрессии генов также сосредоточено на том, где в клетке модулируется экспрессия. Фактически модуляция экспрессии генов может происходить в ядре, цитоплазме или даже на клеточной мембране из-за воздействия белков на РНК в этих клеточных субрегионах.

Как ученые изучают форму и функции белков? Метод, называемый масс-спектрометрией, позволяет ученым определить последовательность аминокислот в белке.После того, как последовательность известна, сравнение ее аминокислотной последовательности с базами данных позволяет ученым обнаружить, существуют ли родственные белки, функция которых уже известна. Часто одинаковые аминокислотные последовательности будут иметь сходные функции в клетке. Аминокислотная последовательность также позволяет ученым предсказать заряд молекулы, ее размер и возможную трехмерную структуру. Заряд и размер позже могут быть подтверждены экспериментально (с помощью SDS-PAGE и двумерных гелей). Чтобы разобраться в тонкостях трехмерной структуры, ученые попытаются кристаллизовать белок, чтобы подтвердить его молекулярную структуру с помощью рентгеновской кристаллографии и/или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (pNMR).

Как ученые изучают влияние белков на гены или другие белки? Хороший способ изучить функцию белка — посмотреть, что происходит в клетке, когда белка нет. Для этого ученые используют модельные системы, такие как клеточная культура или целые организмы, в которых они могут проверять функцию определенных белков или генов, модифицируя или мутируя их. Уровень экспрессии гена можно рассчитать путем измерения транскрибируемой мРНК (нозерн-блоттинг), экспрессированного белка (вестерн-блоттинг) или путем непосредственного окрашивания белка или мРНК, когда они еще находятся в клетке.Новые методы изменили то, как мы изучаем экспрессию генов — ДНК-микрочипы, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и высокопроизводительное секвенирование позволяют проводить более масштабные скрининги нескольких молекул одновременно и открывают возможности для новых и более широких вопросов. Чтобы проанализировать большие наборы данных и увидеть, как взаимодействуют сети молекул, новая дисциплина, называемая системной биологией, обеспечивает основу для этого более широкого и более интегрированного понимания регуляторных сетей.

Интересно, что белки не являются единственными регуляторами генов.Регуляторные молекулы имеют форму РНК и воздействуют на другие нуклеиновые кислоты, изменяя или разрушая их. Одним из примеров является семейство рибопереключателей, молекул рибонуклеиновой кислоты, которые образуют трехмерные структуры, которые останавливают транскрипцию или препятствуют ей при наличии надлежащего внешнего сигнала. Другим примером действия РНК на другие РНК является механизм РНК-интерференции (РНКи), при котором молекулы двухцепочечной РНК перед трансляцией разрушают мРНК, тем самым эффективно препятствуя экспрессии белка.Вскрытие этого механизма и его последующая экспериментальная имитация были благом для тех, кто интересовался манипулированием функциями генов.

В конечном счете, результаты такого рода исследований имеют фундаментальное значение, начиная с базового понимания нормального функционирования клеток, такого как клеточная дифференцировка, рост и деление, и заканчивая предоставлением информации о радикально новых подходах к лечению заболеваний. На самом деле некоторые заболевания человека могут возникать просто из-за дефекта трехмерной структуры белка.Изучая экспрессию генов и белков, легко увидеть, как мельчайшие изменения на молекулярном уровне оказывают сильное влияние.

Изображение: Библиотека биохимических алгоритмов.

Сравнение количества белков и уровней экспрессии мРНК в геномном масштабе | Биология генома

Двумерный электрофорез

Определение относительных уровней экспрессии белка с помощью обычного двумерного электрофореза требует изоэлектрического фокусирования, электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, окрашивания, фиксации, денситометрии и тщательного сопоставления одних и тех же пятен на двух или более гелях.Затем пятна с различной экспрессией вырезают и подвергают ферментативному расщеплению, а полученные пептиды идентифицируют с помощью масс-спектрометрии. Привлекательным аспектом этого подхода является низкая капитальная стоимость оборудования, но для получения воспроизводимых гелей требуется высокий уровень знаний, а двумерный электрофорез обычно ограничивается белками, которые не являются ни слишком кислыми, ни слишком щелочными, ни слишком гидрофобными, и размером от 10 до 200 кДа, так что они надежно разделяются на гелях.Кроме того, этот подход обнаруживает только те белки, которые экспрессируются на относительно высоких уровнях и имеют длительный период полураспада [7, 8]. В одном исследовании с использованием 40 мкг дрожжевого лизата среднее обнаруженное содержание белка составило 51 200 копий на клетку, при этом не было обнаружено белков с содержанием менее 1000 копий на клетку [8]. Учитывая, что 1500 пятен были разрешены на геле с единицей pH 1,0 [8], для разрешения целого клеточного лизата потребуется несколько гелей, охватывающих различные диапазоны pH. Учитывая эти ограничения, традиционная технология двумерного электрофореза имеет ограниченный потенциал для крупномасштабного анализа протеома [8].

Двумерный флуоресцентно-разностный гель-электрофорез (DIGE) использует согласованные по массе и заряду, спектрально разрешаемые флуоресцентные красители (такие как Cy3 и Cy5) для мечения двух разных образцов белка in vitro перед двумерным электрофорезом. Его основное преимущество перед обычным двумерным электрофорезом заключается в том, что и контрольный, и экспериментальный образец анализируются в одном полиакриламидном геле. Затем образцы визуализируются отдельно, но их можно идеально наложить друг на друга без какого-либо «деформирования» гелей.Это существенно повышает достоверность обнаружения и количественной оценки изменений белков между образцами. Могут быть обнаружены изменения относительного уровня экспрессии белка всего в 1,2 раза для пятен большого объема [9]. Поскольку обнаружение основано на флуоресценции, DIGE имеет большой динамический диапазон около 10 000, что позволяет анализировать дифференциальную экспрессию белков, которые присутствуют в относительно низком числе копий [9]. Предел обнаружения DIGE для количественной оценки коэффициентов экспрессии белка составляет от 0.25 и 0,95 нг белка, что аналогично окрашиванию серебром [9, 10]. В недавнем исследовании [11] сравнивали относительные уровни экспрессии примерно 1050 белковых пятен в 250 000 нормальных клеток, подвергшихся лазерной диссекции, и клеток карциномы пищевода. Этот анализ выявил 58 пятен, которые были активизированы более чем в три раза, и 107, которые были подавлены более чем в три раза в раковых клетках.

Методы масс-спектрометрии

Открытие биомаркеров заболеваний

Современные подходы к обнаружению белковых или пептидных маркеров заболеваний включают периодическую хроматографию, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы (MALDI-MS) и статистический анализ большого количества заболеваний по сравнению с нормальной сывороткой или другие биологические образцы.Самые последние исследования основывались на времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией и ионизацией с усилением поверхности (SELDI-TOF-MS) [12, 13]. Подход SELDI [13] предполагает использование покрытого золотом чипа с восемью или шестнадцатью пятнами размером 2 мм, модифицированными хроматографическими поверхностями (например, анионными, катионными, гидрофобными и т. д.). После нанесения нескольких микролитров сыворотки любые загрязнения и соль удаляют промыванием водой, а мишень сушат, добавляя матричный раствор MALDI, такой как α-циано-4-гидроксикоричная кислота.В исследовании Petricoin et al. [14] Анализ SELDI-MS сыворотки 50 контрольных и 50 образцов пациентов с раком яичников привел к идентификации пяти пептидных биомаркеров размером от 534 до 2465 Да. Паттерн, сформированный этими маркерами, был затем использован для правильной классификации всех 50 образцов рака яичников в замаскированном наборе образцов сыворотки от 116 пациентов, включая 50 пациентов с раком яичников и 66 здоровых женщин. Аналогичные многообещающие результаты были получены при исследовании образцов сыворотки больных раком молочной железы и предстательной железы [12, 15].В недавнем исследовании [16], в котором сравнивалась относительная способность нескольких различных статистических подходов к классификации образцов на основе данных МС, подход биомаркеров заболеваний был распространен на обычную платформу MALDI-MS. Несмотря на свою эффективность, подход с использованием биомаркеров заболеваний не дает точных относительных количеств контрольных биомаркеров по сравнению с экспериментальными, а дает только относительную разницу в интенсивности.

Профилирование белков на основе изотопно-кодированных аффинных меток

В то время как обнаружение биомаркеров заболеваний на основе MALDI-MS и DIGE позволяют получить сравнительный профиль встречающихся в природе форм пептидов и белков, анализ изотопно-кодированных аффинных меток (ICAT) профилирует относительные количества цистеинсодержащих пептидов, полученных из триптических гидролизатов белковых экстрактов.Поскольку для количественной оценки экспрессии соответствующего исходного белка необходим только один триптический пептид, в реагенте ICAT используется группа, реагирующая с тиоловым белком, которая присоединяется как к биотиновой метке, так и к девяти 12 C (светлым) или девяти 13 C. (тяжелых) атомов к каждому остатку цистеина. После дериватизации контрольного белкового экстракта реагентом [ 12 C]-ICAT и экспериментального экстракта реагентом [ 13 C]-ICAT объединенные образцы подвергают расщеплению трипсином с последующей катионной и авидиновой хроматографией.Затем используют жидкостную хроматографию и тандемную масс-спектрометрию (ЖХ/МС/МС) для идентификации пар пептидов ICAT и количественного определения относительных соотношений 12 C/ 13 C. Важно отметить, что подход ICAT обеспечивает относительные коэффициенты экспрессии отдельных белков при двух условиях; он не дает ни абсолютных концентраций белков, ни соотношения концентраций одного белка по отношению к другому в единичных условиях. Приятной особенностью этого подхода является то, что включение стабильного изотопа in vitro в один из двух сравниваемых образцов устраняет необходимость раздельного анализа контрольных и экспериментальных образцов методом МС.Хотя триптический гидролиз экстракта цельноклеточного белка человека может продуцировать более 500 000 пептидов, можно ожидать, что менее 100 000 из них будут содержать цистеин, но на основании поиска в базе данных SwissProt [17] менее 5 % белков человека в белках отсутствует цистеин, и поэтому они будут пропущены (то есть более 95% белков будут включать по крайней мере один цистеинсодержащий пептид).

Результаты ICAT аналогичны результатам, полученным при использовании двух различных флуоресцентных красителей в ДНК-микрочиповом анализе уровней мРНК или DIGE-анализе экспрессии белка.Наибольшее количество белков, профилированных до сих пор с использованием этого подхода с одним образцом, составляет 491 белок, содержащийся в микросомальных фракциях наивных и дифференцированных in vitro клеток миелоидного лейкоза человека [18].

Технология многомерной идентификации белков

Технология многомерной идентификации белков (MudPit) аналогична ICAT тем, что в ней используется предварительное катионообменное фракционирование с последующим разделением с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой (ОФ) и анализом МС/МС [ 19].Однако, в отличие от подхода ICAT, MudPit анализирует всю смесь белков, расщепленных трипсином, и использует колонки с тандемным сопряжением (катионообмен с последующей обращенной фазой). Конкретное подмножество пептидов элюируют из катионообменной колонки с использованием ступенчатого градиента возрастающей концентрации соли на переднюю часть колонки RP. Затем пептиды элюируют из колонки RP и вводят в масс-спектрометр для анализа. После завершения градиента RP на следующем этапе градиента соли высвобождается другое подмножество пептидов из катионообменной колонки на колонку RP, и процесс повторяется.Используя этот подход к протеому дрожжей, Wolters et al. [19] идентифицировал 5540 уникальных пептидов из 1484 белков и продемонстрировал 10000-кратный динамический диапазон обнаружения. Этот метод был распространен на сравнительное профилирование белков с использованием метаболического мечения in vivo 14 N/ 15 N [20, 21]. Уошберн и др. [20] использовали Saccharomyces cerevisiae , выращенные как на 14 N-, так и на 15 N-содержащих минимальных средах, и однозначно идентифицировали 2264 пептида и 872 белка.Кроме того, для каждого пептида было определено точное количественное определение 14 N/ 15 N со средним стандартным отклонением 30%.

Сравнение уровней мРНК и белка

Несмотря на значительное развитие технологий, используемых для количественного определения содержания белка за последние пару лет, идентификация и количественный анализ белка все еще отстают от высокопроизводительных экспериментальных методов, используемых для определения уровней экспрессии мРНК. Тем не менее, хотя значения экспрессии мРНК показали свою полезность в широком диапазоне приложений, включая диагностику и классификацию рака [22, 23], эти результаты почти наверняка являются только корреляционными, а не причинными; в конце концов, наиболее вероятно, что концентрация белков и их взаимодействие являются истинными причинными силами в клетке, и именно соответствующие количества белков мы должны изучать.

В первую очередь из-за ограниченных возможностей измерения количества белка исследователи попытались найти корреляции между мРНК и ограниченными данными об экспрессии белка в надежде, что они смогут определить уровни содержания белка из более обширных и технически более простых экспериментов с мРНК. В качестве альтернативы, если нет окончательной корреляции между данными об мРНК и белках, обе величины могут использоваться как независимые источники информации для использования в алгоритмах машинного обучения, например, для прогнозирования взаимодействий белков.На сегодняшний день было предпринято лишь несколько попыток найти корреляции между уровнями экспрессии мРНК и белка, особенно в раковых клетках человека и дрожжевых клетках; по большей части они сообщили только о минимальных и/или ограниченных корреляциях.

Один из первых анализов корреляции рассматривал 19 белков в печени человека. Андерсон и Сейлхамер [24] обнаружили несколько положительную корреляцию 0,48. Другой ограниченный анализ трех генов MMP-2, MMP-9 и TIMP-1 при раке предстательной железы человека не показал значимой взаимосвязи [25].Дополнительное исследование рака [26] показало значительную корреляцию только в небольшом подмножестве изученных белков. И наоборот, Orntoft et al. [27] обнаружили очень значимые корреляции в карциномах человека при изучении изменений уровней экспрессии мРНК и белка.

Корреляции белков и мРНК в дрожжах

Многие из современных попыток корреляции экспрессии мРНК и белков были проведены в дрожжах с использованием методов двумерного электрофореза. В частности, Gygi et al. [7] обнаружили, что даже одинаковые уровни экспрессии мРНК могут сопровождаться широким диапазоном (до 20-кратной разницы) уровней содержания белка, и , наоборот. Эти результаты контрастируют с результатами Futcher et al. [28], которые обнаружили относительно высокие корреляции ( r = 0,76) после преобразования данных к нормальным распределениям. В предыдущем анализе [29] мы объединили данные из обоих этих наборов данных (называемых 2DE-1 [7] и 2DE-2 [28]), сравнив получившийся новый более крупный набор данных об изобилии белка («объединенный набор данных»). 1′) с полным набором данных по экспрессии мРНК.Эталонный набор экспрессии мРНК был создан путем итеративного объединения нетривиальным образом трех наборов, в которых использовались чипы Affymetrix и набор данных SAGE [29]. Используя эти эталонные наборы данных, мы смогли провести сравнение уровней экспрессии мРНК и белка «все против всех», в дополнение к ряду анализов, сравнивающих экспрессию белка и мРНК с использованием более мелких, но широких категорий [29, 30].

Учитывая сложный, трудоемкий и ограниченный характер двумерного электрофоретического анализа, многие из новых определений содержания белка были выполнены с использованием MudPit и производных технологий.Уошберн и др. [31] использовали MudPit для анализа и обнаружения 1484 произвольных белков: они смогли обнаружить несколько случайных выборок белков, не зависящих от количества, локализации, размера или гидрофобности (мы называем этот набор данных MudPit-1). В другом эксперименте авторы, сравнивая коэффициенты экспрессии как для белков, так и для уровней мРНК, обнаружили, что, хотя они не могли найти корреляции для отдельных локусов, они могли найти общие корреляции при изучении путей и комплексов белков, которые функционировали вместе [21].Пэн и др. [32] проанализировал 1504 белка дрожжей с частотой ложноположительных результатов — ошибочной идентификации белка — менее 1% (мы называем этот набор данных MudPit-2). В своем анализе [32] они сравнили свою методологию с методологией Washburn et al. [31], с которым имело место значительное перекрытие белков.

Новый объединенный набор данных

Расширяя наш предыдущий объединенный набор данных, мы создали новый объединенный набор данных (объединенный набор данных-2), используя два двумерных электрофореза и два набора данных MudPit, описанных выше.Вкратце (дополнительная информация доступна на нашем веб-сайте по адресу [33]), мы преобразовали каждый из наборов данных о содержании белков в более количественные данные, подгоняя каждый набор данных о белках отдельно к эталонному набору данных об экспрессии мРНК. Набор данных MudPit-1 также был адаптирован к более детализированному набору данных MudPit-2. Затем каждый из новых подобранных наборов данных был обратно преобразован обратно в белковое пространство. Затем эти производные наборы данных о белках были объединены в более крупный эталонный набор данных; когда у нас было более одного значения численности для открытой рамки считывания (ORF), мы выбирали значение из набора данных в соответствии с предписанным рейтингом качества (см. Рисунок 1).Полученный набор содержал информацию об изобилии белка примерно для 2000 ORF. (Одно предостережение относительно данных MudPit: в то время как количественный анализ может быть впоследствии выполнен на основе результатов экспериментов MudPit, сами по себе данные MudPit являются только полуколичественными, поскольку количество определяемых пептидов соотносится с фактическим содержанием белка в клетке [31]. Поэтому некоторые могут утверждать, что MudPit сам по себе не оптимален для сравнения с данными мРНК. Тем не менее, мы считаем, что наш методический процесс слияния создает количественный и репрезентативный набор данных, который можно сравнить с данными экспрессии мРНК.) Используя полученные данные, мы могли сравнить экспрессию мРНК и изобилие белка в глобальном масштабе (рис. 1а), а также рассмотреть более мелкие, широкие категории, такие как функция или локализация (см. рис. 1b, 1c). В частности, мы показываем, что некоторые категории локализации — например, ядрышко — имеют значительно более высокие корреляции, чем глобальная корреляция. Другие локализации могут представлять меньшую корреляцию между данными мРНК и белка — например, митохондрии — возможно, отражая гетерогенную природу и функцию последней органеллы.С точки зрения функциональных категорий MIPS [34, 35] мы показываем, что, хотя некоторые категории, такие как спасение клеток, демонстрируют более низкую корреляцию, чем весь объединенный набор, другие функциональные категории, такие как клеточный цикл, демонстрируют значительное увеличение корреляции. Логически, эта повышенная корреляция отражает корегулируемую природу белков этой функциональной категории.

Рисунок 1

Сравнение экспрессии мРНК и содержания белка. (a) График, сравнивающий наш эталонный набор экспрессии мРНК [29] с нашим недавно скомпилированным набором данных об изобилии белка.Ось мРНК указана в копиях на клетку; ось белка в тысячах копий на клетку. Набор данных о белке является результатом итеративной подгонки двух наборов данных MudPit (MudPit-1 [32] и MudPit-2 [31]) и двух наборов данных двумерного электрофореза (2DE-1 [7] и 2DE-2 [28]). Учитывая полуколичественный характер данных MudPit [31], мы преобразовали данные в более количественный набор, подгоняя каждый набор по отдельности к нашему эталонному набору данных экспрессии мРНК. Кроме того, мы подгоняем набор данных MudPit-1 к более детализированному набору данных MudPit-2.Затем каждый из наборов данных был перемещен обратно в «белковое пространство» с использованием обратного преобразования, полученного из набора 2DE-1, поскольку этот набор имеет наиболее точные значения. Затем эти наборы данных были объединены в новый эталонный набор данных по численности. В случаях, когда были перекрывающиеся значения для данной ORF, мы использовали набор данных в соответствии со следующим порядком: 2DE-1, 2DE-2, MudPit-2, MudPit-1. Полученный эталонный набор данных об изобилии белка ( N = 2044) имел корреляцию 0,66 с эталонным набором данных мРНК. (b,c) Кроме того, мы показываем, что при рассмотрении определенных подмножеств (субклеточная локализация [52] или функциональные группы [34, 35]) мы можем найти как более высокие, так и более низкие корреляции между этими группами. Более низкие корреляции обычно отражают более разнородную категорию. Этот анализ показывает, что, хотя корреляции могут быть слабыми при просмотре глобальных данных, мы склонны обнаруживать более высокие корреляции при просмотре меньших четко определенных подмножеств ORF. Дальнейший анализ доступен в [33].

Причины отсутствия корреляции

Предположительно существует по крайней мере три причины плохих корреляций, о которых обычно сообщается в литературе, между уровнем мРНК и уровнем белка, и они могут не быть взаимоисключающими. Во-первых, существует множество сложных и разнообразных посттранскрипционных механизмов, участвующих в превращении мРНК в белок, которые еще недостаточно хорошо определены, чтобы можно было вычислить концентрацию белка по мРНК; во-вторых, белки могут существенно различаться по времени полужизни in vivo; и/или в-третьих, существует значительное количество ошибок и шума как в экспериментах с белками, так и с мРНК, что ограничивает нашу способность получить четкую картину [36, 37].

Изучая первый вариант — что между транскрипцией и трансляцией существует ряд сложных стадий — мы рассмотрели корреляции между содержанием мРНК и белка для тех ORF, которые имели различные или устойчивые уровни экспрессии мРНК в течение клеточного цикла [38]. ]. Чтобы нормализовать различные степени экспрессии для различных ORF, мы взяли стандартное отклонение, деленное на средний уровень экспрессии, как репрезентативное изменение каждой ORF в течение клеточного цикла дрожжей (рис. 2).Вообще говоря, клетка может контролировать уровни белка на уровне транскрипции и/или на уровне трансляции. Логически можно было бы предположить, что те ORF, которые показывают большую степень изменчивости в своей экспрессии, контролируются на уровне транскрипции — вариабельность экспрессии мРНК указывает на то, что клетка контролирует экспрессию мРНК в разные моменты клеточного цикла для достижения результирующего и желаемый уровень белка. Таким образом, мы ожидали и обнаружили высокую степень корреляции ( r = 0.89) между эталонными уровнями мРНК и белка для этих конкретных ORF; клетка уже вложила значительную энергию в определение конечного уровня белка посредством жесткого контроля над экспрессией мРНК, и мы предполагаем, что тогда контроль на уровне белка будет минимальным. Напротив, те гены, которые показывают минимальные изменения в экспрессии их мРНК на протяжении клеточного цикла, с большей вероятностью будут иметь небольшую корреляцию или не иметь никакой корреляции с конечным уровнем белка; клетка будет контролировать эти ORF на трансляционном и/или посттрансляционном уровне, при этом уровни мРНК в некоторой степени не зависят от конечной концентрации белка.И действительно, мы обнаружили только минимальную корреляцию между экспрессией белка и мРНК для этих ORF ( r = 0,2).

Рисунок 2

Различия в корреляции между значениями экспрессии мРНК и белка с использованием новых категорий. Мы видим значительные различия при рассмотрении самых высоких и самых низких рейтингов групп ORF в следующих категориях: занятость, значение CAI (индекс адаптации кодонов) [45–47] и вариабельность. Занятость относится к проценту транскриптов, связанных с рибосомами; мы сравнили корреляцию между 100 верхними ORF и нижними 100 с точки зрения занятости ( r = 0.78 против 0,30). Для CAI мы сравнили корреляцию между мРНК и белком для ORF с самым высоким CAI и с самым низким ( r = 0,48 против 0,02). Вариабельность относится к нормализованному стандартному отклонению (то есть стандартному отклонению, деленному на средний уровень экспрессии) для всех ОРС в наборе данных экспрессии клеточного цикла Cho et al . [38]. Здесь мы сравнили корреляции между содержанием белка и экспрессией мРНК для наиболее вариабельных белков по сравнению с наименее вариабельными ( r = 0.89 против 0,20). Мы обнаружили значительные различия между корреляциями уровней мРНК и белка для популяций с верхним и нижним рангом для каждого из сравнений.

Кроме того, мы обнаружили, что те ORF, которые имеют уровни заполнения рибосомами выше среднего, то есть большой процент их клеточной концентрации мРНК связан с рибосомами (транслируемыми), имеют хорошо коррелированные уровни экспрессии мРНК и белка (рис. 2). ). Эти случаи, вероятно, представляют собой ситуацию, когда клетка, в значительной степени контролирующая экспрессию мРНК для продукции определенного уровня белка, вероятно, не будет также использовать механизмы для контроля трансляции.С другой стороны, те белки, которые имеют очень низкую степень заполнения, имеют некоррелированную экспрессию мРНК и белка; таким образом, учитывая, что клетка не контролировала строго экспрессию мРНК для этой ORF, она будет диктовать результирующие уровни белка посредством строгого контроля его трансляции (т.е. посредством жестких ограничений на занятость) [39].

Второй вариант общего отсутствия корреляции между содержанием мРНК и белка может заключаться в том, что белки имеют очень разные периоды полураспада в результате различного синтеза и деградации белка.Обмен белка может значительно варьироваться в зависимости от ряда различных условий [40]; клетка может контролировать скорость деградации или синтеза для данного белка, и существует значительная гетерогенность даже среди белков, которые имеют сходные функции [41]. Недавно были предприняты попытки компьютерного измерения этих показателей [42].

Упрощенно можно предположить, что изменение концентрации белка с течением времени будет равно скорости трансляции минус скорость деградации.По аналогии с понятиями химической кинетики можно аппроксимировать это уравнение: ), где P — обилие белка i в момент времени t, E — уровень экспрессии мРНК белка P, S — общая скорость синтеза белка на мРНК, а D — общая скорость деградации белка на белок [43]. Кроме того, существуют некоторые экспериментальные методы, которые также можно использовать для измерения оборота и трансляционного контроля уровня белка [41–44].

Учитывая вырожденный характер генетического кода, существует множество синонимичных кодонов (кодонов, которые транслируются в одну и ту же аминокислоту). Поскольку клетка склонна использовать синонимичные кодоны, то есть использование подмножества кодонов приводит к более высокому уровню экспрессии мРНК, возможно, в результате различных уровней клеточной тРНК [45], индекс адаптации кодонов (CAI ), измерение использования кодонов, можно использовать для прогнозирования экспрессии гена [46] (недавно мы рассчитали новые параметры для этой модели с некоторым улучшением предсказательной силы [47]).Считается, что CAI будет по-разному коррелировать с уровнями мРНК, чем с уровнями содержания белка, частично из-за скорости оборота белка [48]. Ранжируя ORF с точки зрения их значения CAI, мы обнаружили, что, хотя те ORF, которые заняли самые высокие места с точки зрения CAI, не показали очень сильной корреляции между уровнями мРНК и белка, они, тем не менее, показали значительно более высокую корреляцию, чем ORF, которые были ранжированы как имеющие более низкие значения CAI ( r = 0,48 против 0,02). Низкие корреляции отражают тот факт, что CAI будет по-разному коррелировать для значений белка и мРНК из-за дополнительных клеточных контролей трансляции белка, а именно влияния скорости оборота белка.Тем не менее значительная разница в корреляциях между двумя группами ORF с высокими и низкими значениями CAI (рис. 2) показывает, что существует некоторая связь между значениями мРНК и белка, что, возможно, указывает на то, что высоко экспрессированные гены имеют тенденцию приводить к более коррелирует уровень обилия белка, чем более низкие выраженные.

Обнаружены корреляции между уровнями экспрессии мРНК различных белковых субъединиц в составе белковых комплексов [49]. Это означает, что в целом должна существовать корреляция между содержанием мРНК и белка, поскольку эти субъединицы представляют собой особый случай, поскольку они должны быть доступны в стехиометрических количествах белков для функционирования комплексов.Таким образом, мы считаем, что основным ограничением для обнаружения корреляций является степень естественного и искусственно созданного систематического шума в экспериментах по экспрессии мРНК и белка. Продолжаются попытки как описать, так и уменьшить этот шум [50]. Между тем, в попытке обойти шум можно рассмотреть широкие категории белков — например, группы, определяемые функцией, структурой или локализацией — так, чтобы фоновый шум в некоторой степени компенсировался [29].

Хотя протеомика все еще находится в зачаточном состоянии, учитывая темпы технического прогресса в области количественного определения белков, анализа экспрессии мРНК и подавления шума, вскоре станут возможными более всесторонние корреляционные исследования.Это позволит провести более надежный анализ взаимосвязи между экспрессией мРНК и значениями содержания белка. Наконец, чтобы полностью понять взаимосвязь между содержанием мРНК и белка, необходимо лучше понять динамические процессы, участвующие в синтезе и деградации белка; изменяется ли уровень белка из-за изменения скорости синтеза белка, или мРНК, или оборота белка? Эти вопросы требуют дальнейшего изучения, прежде чем мы сможем в полной мере оценить взаимосвязь между уровнями содержания мРНК и белка.

Руководство по экспрессии белков I Введение в методы экспрессии белков

Основные принципы биологии перевода

Портфолио существующих на сегодняшний день систем, хотя и охватывает широкий и разнообразный спектр, все они подпадают под один из двух типов бесклеточных систем экспрессии: системы трансляции и системы сопряженной транскрипции и трансляции (TnT ® ). Несмотря на различия между системами, основные принципы бесклеточной реакции остаются теми же.

Бесклеточная экспрессия начинается с неочищенных экстрактов, полученных из культивируемых клеток, которые обычно вовлечены в высокий уровень синтеза белка, таких как незрелые эритроциты (ретикулоциты). Эти неочищенные экстракты лишены эндогенной ДНК и мРНК, а клеточный лизат впоследствии дополняется макромолекулярными компонентами, необходимыми для выполнения трансляции, включая рибосомы, тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы и факторы инициации, элонгации и терминации. Затем инициируют процесс трансляции путем добавления подходящей матрицы (ДНК или мРНК) и осуществляют при соответствующей температуре.В системах трансляции реакции инициируются очищенной мРНК, тогда как системы, которые инициируются линейными или плазмидными матрицами ДНК, называются системами сопряженной транскрипции и трансляции (TnT ® ).

Для обеспечения эффективной трансляции каждый экстракт требует дополнительного добавления аминокислот, источников энергии (АТФ, ГТФ), систем регенерации энергии и солей (например, Mg 2+ , K + ). Креатинфосфат и креатинфосфокиназа обычно служат системами регенерации энергии в эукариотических системах, тогда как прокариотические системы часто дополняются фосфоенолпируватом и пируваткиназой.Кроме того, сопряженные системы транскрипции и трансляции также обычно снабжены РНК-полимеразой фагового происхождения (T3, T7 или SP6), которая транскрибирует мРНК с экзогенной ДНК-матрицы и обеспечивает экспрессию генов, клонированных ниже промотора T3, T7 или SP6.

Экстракт клеток и выбор системы

Когда дело доходит до выбора подходящей для вас бесклеточной системы экспрессии белков, необходимо учитывать несколько факторов, в том числе тип матрицы, которую вы будете использовать, желаемый выход белка и предполагаемые последующие приложения.

На сегодняшний день наиболее популярные коммерчески доступные системы трансляции in vitro состоят из E. coli , зародышей пшеницы, ретикулоцитов кролика или экстрактов клеток насекомых. Поскольку каждая из этих клеток ведет себя и функционирует по-разному, то же самое относится и к их производным экстрактам, и каждая из них имеет свои преимущества и недостатки, которые кратко описаны ниже (1; 3).

Прокариотическая система E. coli в настоящее время является самой популярной системой экспрессии белков по нескольким причинам. E. coli  приготовление к экстракции является простым и недорогим, поскольку E. coli  легко ферментируется в больших количествах с использованием недорогих сред и легко разрушается с помощью гомогенизаторов высокого давления. Системы на основе E. coli также обычно достигают самых высоких выходов белка, а общая стоимость реакции системы E. coli является самой низкой в ​​совокупности. E. coli способна активировать метаболические реакции в экстракте, что, в свою очередь, способствует высокоуровневому синтезу белка, что устраняет необходимость в более дорогих энергетических субстратах, таких как фосфоенолпируват.

Экстракт зародышей пшеницы (WGE), лизат ретикулоцитов кролика (RRL) и экстракт клеток насекомых (ICE) в настоящее время являются наиболее широко используемыми эукариотическими системами. Эти системы выгодны для производства более сложных белков, а также могут достигать посттрансляционных модификаций, которые не обнаружены в E. coli . Однако эти эукариотические системы обычно включают более трудоемкие процедуры приготовления экстракта, что может увеличить стоимость. Эукариотические системы также имеют тенденцию к более низкому выходу белка в периодических реакциях по сравнению с Е.coli системы.

Бесклеточные экстракты зародышей пшеницы и лизат ретикулоцитов кролика поддерживают трансляцию in vitro широкого спектра вирусных, прокариотических и эукариотических мРНК. Эти управляемые РНК системы широко используются для идентификации видов мРНК и характеристики их продуктов. Начиная с интересующей ДНК, транскрипты in vitro (5–80 мкг/мл) для трансляции можно создавать с помощью крупномасштабных систем производства РНК RiboMAX™ (кат. № P1280, P1300) и системы крупномасштабного производства РНК T7 RiboMAX™ Express. (Кот.# Р1320).

Экстракт E. coli S30 (ЕЭК):

Преимущества : Подготовка к экстракции проста и экономична. Системы ECE обладают способностью сворачивать сложные белки, постоянно имеют высокую скорость синтеза белка и, как следствие, высокий выход синтеза белка. Кроме того, источники энергии дешевы, современные методы хорошо изучены, а также существует множество хорошо зарекомендовавших себя инструментов для выполнения генетических модификаций.

Недостатки : Количество необязательных посттрансляционных модификаций ограничено, и отсутствуют эндогенные мембранные структуры для синтеза интегральных мембранных белков.

Экстракт зародышей пшеницы (WGE):

Преимущества:  Широкий спектр экспрессии эукариотических белков неоднократно достигался с использованием WGE. Это также высокопродуктивная система, которая обеспечивает высокий выход сложных белков. Сложный высокопроизводительный метод протеомики.

Недостатки: Приготовление лизата может быть дорогим и трудоемким. Возможны ограниченные посттрансляционные модификации, нет эндогенных мембранных структур для синтеза интегральных мембранных белков, а WGE предлагает низкий выход белка по сравнению с прокариотическими системами.

Лизаты ретикулоцитов кролика (RRL):

Преимущества: Клетки легко разрушаются, а процесс подготовки к экстракции проходит быстро. Система РРЛ – это проверенная и хорошо зарекомендовавшая себя система. Эта система хорошо подходит для эукариотических модификаций системы млекопитающих с умеренным/низким выходом белка.

Недостатки : Низкий выход белка. Посттрансляционные модификации возможны только за счет добавления экзогенных микросомальных мембран.

Экстракт клеток насекомых (ICE):

Преимущества Клетки легко разрушаются, а процесс подготовки к экстракции выполняется быстро. С использованием этого экстракта возможны многие эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование, образование дисульфидных мостиков, липидирование и фосфорилирование расщепления сигнального пептида. Эндогенные микросомы также доступны, и прямой синтез и интеграция мембранных белков были успешно выполнены с использованием этого экстракта.

Недостатки : Экстракты клеток насекомых, как правило, имеют высокие затраты на выращивание.

Готовы начать поиск вашей системы? Изучите широкий спектр продуктов для экспрессии белков, чтобы найти правильное решение для ваших потребностей в бесклеточной экспрессии белков.

Преимущества бесклеточных систем экспрессии белков

Бесклеточные системы экспрессии белков предлагают несколько явных преимуществ по сравнению с экспрессией белков на основе клеток, включая повышенный общий выход полноразмерных белков, которые являются одновременно функциональными и растворимыми, а также значительную экономию времени.Типичные методы in vivo могут занять в лучшем случае дни, а в худшем случае недели (4). Напротив, реакции трансляции in vitro, включая время, затрачиваемое на приготовление экстрактов, могут быть выполнены всего за несколько часов, что обеспечивает самый быстрый способ корреляции фенотипа (функция экспрессируемого белка) с генотипом.

Используя бесклеточный подход, синтез белка также универсален, поскольку он может выполняться с использованием различных входных данных. Бесклеточные системы трансляции используют мРНК в качестве матрицы, в то время как плазмидная ДНК или линейные ПЦР-фрагменты могут служить матрицей ДНК в сопряженных системах транскрипции/трансляции.

Белки — что это такое и как они производятся — Science Learning Hub

Белки — это ключевые рабочие молекулы и строительные блоки всех клеток. Во всех организмах они производятся в ходе аналогичного двухэтапного процесса, называемого синтезом белка: сначала ДНК транскрибируется в РНК, а затем РНК транслируется в белок.

Перед отдельными генами последовательности ДНК, называемые промоторами, определяют, когда и в каких количествах производятся белки.

Что такое белок?

Белки являются основными «рабочими молекулами» в каждом организме.Среди множества своих функций белки катализируют реакции, переносят кислород и защищают организмы от инфекций. Они также являются важными строительными блоками организмов. Они являются основными компонентами шерсти, хрящей и молока, упаковывают ДНК в хромосомы и изолируют клетки нервной системы. Короче говоря, белки чрезвычайно важны!

Белки состоят из большого количества аминокислот, соединенных встык. Цепочки складываются, образуя трехмерные молекулы сложной формы — это можно представить как оригами из очень длинного и тонкого листа бумаги.Точная форма каждого белка вместе с содержащимися в нем аминокислотами определяет то, что он делает.

Белки экспрессируются генами

Все организмы производят белки практически одинаково. Процесс начинается с гена — «инструкции» по созданию белка. По этой причине процесс создания белка также называют экспрессией генов.

Экспрессия генов состоит из двух основных стадий: транскрипции и трансляции.

Транскрипция

Структуры в клетке идентифицируют начало и конец гена и считывают последовательность ДНК между ними (порядок оснований A, C, G и T в гене).Создается молекулярное сообщение (молекула мРНК), которое повторяет последовательность самого гена. Во многих отношениях мРНК похожа на одноцепочечный фрагмент ДНК.

Трансляция

Рибосома получает молекулу мРНК и начинает строить цепочку аминокислот (белок), точно соответствующую инструкциям мРНК. Рибосома «считывает» последовательность мРНК как серию фрагментов или кодонов из трех оснований. Каждый кодон сообщает механизму синтеза белка, какую аминокислоту добавить следующей.

Генетический код практически одинаков во всей природе

Примечательно, что на протяжении всей жизни каждый кодон имеет одно и то же «значение» в любой данной клетке (с несколькими незначительными исключениями). Например, кодон AGA — это инструкция по добавлению аминокислоты аргинина к растущему белку, независимо от того, растет ли этот белок в бактериальных клетках или клетках человека. Другими словами, каждая клетка следует одним и тем же правилам, чтобы создать новый белок.

Дополнительную информацию см. в статье Как добавить чужеродную ДНК к бактериям.

Какие белки производятся, когда – сила промотора

В любой клетке в любой момент времени вырабатывается только часть белков. Белки, которые выполняют важные функции, вырабатываются постоянно, в то время как другие экспрессируются только тогда, когда они необходимы. Клетки также нуждаются в большом количестве некоторых белков (таких как ферменты, участвующие в непрерывных процессах, таких как транскрипция и трансляция) и меньшем количестве других (таких как гормоны). Но как клетка решает, какие гены экспрессировать и в каком количестве?

Промоторы — это последовательности ДНК, определяющие время экспрессии гена.Эти участки ДНК располагаются перед генами и обеспечивают «посадочную площадку» для факторов транскрипции (белков, которые включают и выключают экспрессию генов) и РНК-полимеразы (белка, который считывает ДНК и создает копию мРНК). Различные последовательности промоторов имеют разную силу, и гены с «сильными» промоторами экспрессируются на более высоком уровне, чем гены со «слабыми» промоторами.

Промоутеры и цвет мякоти яблок

В компании Plant & Food Research Ричард Эспли и его коллеги изучают роль промоутеров в определении того, белая или красная мякоть у яблок.Группа обнаружила фактор транскрипции (MYB10), который связывается с промотором нескольких генов, которые производят красный пигмент в яблоках, вызывая их экспрессию. В яблоках с красной мякотью гораздо больше MYB10, чем в яблоках с белой мякотью, поэтому эти гены пигмента экспрессируются на более высоком уровне и производят больше красного пигмента.

Узнайте больше в статье: От чего зависит цвет мякоти яблок.

Белки и экспрессия генов

В этих статьях содержится дополнительная информация об экспрессии генов и белках.

Атлас расположения белков в клетках. Разные органы выполняют разную работу внутри тела. Разные ткани выполняют разную работу внутри органов. Точно так же разные клетки в тканях. А внутри клеток различные органеллы — известные субклеточные компоненты, такие как ядра, митохондрии и тельца Гольджи — также специализированы для выполнения определенных функций. Каждый из этих уровней организации на протяжении многих лет был каталогизирован в так называемых атласах, начиная с 1543 г. с работы Андреаса Везалия «De Humani Corporis Fabrica» («О ткани человеческого тела»), основополагающего текста современная анатомия.

Последний уровень детализации — изучение различных белков внутри органелл. Белки — это молекулы, которые выполняют большую часть работы внутри клетки. Они варьируются от таких вещей, как актин и миозин, которые взаимодействуют, сгибая мышечные клетки — и, следовательно, мышцы, частью которых являются эти клетки, — до ферментов цикла Кребса, которые разлагают глюкозу, чтобы высвободить содержащуюся в ней энергию. База данных Cell Atlas, запущенная 4 декабря на собрании Американского общества клеточной биологии, записывает, какие белки в каких органеллах обнаружены.Результат, как и «De Humani Corporis Fabrica», одновременно приятен для глаз и важен для поля. Белки, расположенные вместе, скорее всего, будут работать вместе, поэтому знание местонахождения белка в клетке поможет исследователям определить его работу.

Авторы клеточного атласа под руководством Матиаса Улена из Королевского технологического института в Стокгольме с помощью иммунофлуоресценции таким образом определили 12 051 белок. В этом методе используются специально созданные антитела (белковые молекулы, вырабатываемые клетками иммунной системы, которые специфически связываются с определенным белком-мишенью), чтобы выследить эту цель внутри клетки.К самим антителам прикреплены флуоресцентные метки, поэтому они светятся при воздействии ультрафиолетового света. Применяя эти меченые антитела к клеткам из 22 линий клеток человека, полученных из ряда исходных тканей, авторы атласа дали себе наилучшие шансы обнаружить конкретный белок в клетках по крайней мере одной линии. После этого каждый образец исследовали под микроскопом, чтобы определить, в какой из 13 общепризнанных органелл присутствует каждый белок.Эта непростая задача (и не легко делегируемая автоматическим системам оптического распознавания) частично выполнялась группой из 120 000 энтузиастов-любителей.

В примере на рисунке показано распределение белка (помеченного зеленым) под названием ZNF554. Он принадлежит к группе факторов транскрипции «цинковые пальцы», задачей которых является активация и регулирование генов. Как видно из рисунка, ZNF554 ограничен ядром клетки. В этом ядре есть несколько мест, которые светятся особенно ярко, и где его, следовательно, особенно много.Это ядрышки — зоны, где гены особенно активны. (Красные области — это микротрубочки клетки. Они действуют как ее скелет и помечены на всех изображениях Cell Atlas, чтобы очертить границы клетки.)

Какая часть человеческих белков в настоящее время охватывается Cell Atlas, остается открытым. Количество генов, кодирующих белок, в геноме человека в настоящее время составляет 19 628. Однако некоторые гены могут давать более одного белка — либо потому, что они могут быть прочитаны более чем одним способом, либо потому, что их сообщения к частям клетки, производящим белок, могут в конечном итоге редактироваться по-разному.Это означает, что фактическое количество белков, которые могут время от времени существовать в организме, превышает количество генов, вероятно, по крайней мере на 50%. Клеточный атлас, таким образом, ни в коем случае не является последним словом в вопросе о том, где находятся белки. Но это хорошее начало.

Эта статья появилась в разделе «Наука и технологии» печатного издания под заголовком «Совокупность знаний».

Новые белки для редактирования программируемых генов, обнаруженные вне систем CRISPR За последнее десятилетие ученые адаптировали системы CRISPR от микробов к технологии редактирования генов, точной и программируемой системе для модификации ДНК.Теперь ученые из Института Макговерна при Массачусетском технологическом институте и Института Броуда при Массачусетском технологическом институте и Гарварде открыли новый класс программируемых систем модификации ДНК, называемых OMEGA (обязательная активность, управляемая мобильным элементом), которые естественным образом могут участвовать в перетасовке небольших фрагментов ДНК в бактериальных геномах.

Эти древние ферменты, разрезающие ДНК, направляются к своим мишеням маленькими кусочками РНК. Хотя они возникли в бактериях, теперь они были спроектированы для работы в клетках человека, что позволяет предположить, что они могут быть полезны при разработке методов редактирования генов, особенно потому, что они малы (~ 30% размера Cas9), что упрощает их доставку. к клеткам, чем более объемные ферменты.Открытие, опубликованное в журнале Science , свидетельствует о том, что естественные ферменты, управляемые РНК, являются одними из самых распространенных белков на земле, указывая на обширную новую область биологии, которая готова совершить следующую революцию в технологии редактирования генома.

Исследованием руководил исследователь McGovern Фэн Чжан, профессор нейробиологии Джеймса и Патриции Пойтрас в Массачусетском технологическом институте, исследователь Медицинского института Говарда Хьюза и член основного института Института Броуда.Команда Чжана изучает природное разнообразие в поисках новых молекулярных систем, которые можно рационально запрограммировать.

«Мы очень взволнованы открытием этих широко распространенных программируемых ферментов, которые все это время прятались у нас под носом», — говорит Чжан. «Эти результаты предполагают заманчивую возможность того, что существует гораздо больше программируемых систем, которые ждут открытия и разработки в качестве полезных технологий».

Программируемые ферменты, особенно те, которые используют направляющую РНК, могут быть быстро адаптированы для различных целей.Например, ферменты CRISPR естественным образом используют направляющую РНК для нацеливания на вирусных захватчиков, но биологи могут направить Cas9 на любую мишень, создав собственную направляющую РНК. «Так легко просто изменить последовательность направляющих и установить новую цель», — говорит аспирант и соавтор статьи Сумия Каннан. «Итак, один из общих вопросов, которые нас интересуют, — попытаться увидеть, используют ли другие природные системы такой же механизм».

Первые намеки на то, что белки OMEGA могут управляться РНК, исходили от генов белков, называемых IscB.IscB не участвуют в иммунитете CRISPR и, как известно, не связываются с РНК, но они выглядят как небольшие ферменты, разрезающие ДНК. Команда обнаружила, что рядом с каждым IscB закодирована небольшая РНК, и это направляет ферменты IscB на разрезание определенных последовательностей ДНК. Они назвали эти РНК «ωРНК».

Эксперименты группы показали, что два других класса малых белков, известных как IsrB и TnpB, одни из самых распространенных генов у бактерий, также используют ωРНК, которые действуют как направляющие для управления расщеплением ДНК.

IscB, IsrB и TnpB обнаружены в мобильных генетических элементах, называемых транспозонами. Аспирант Хан Алтаэ-Тран, соавтор статьи, объясняет, что каждый раз, когда эти транспозоны перемещаются, они создают новую направляющую РНК, позволяя кодируемому ими ферменту разрезаться где-то еще.

Неясно, какую пользу бактерии получают от этой геномной перетасовки — и получают ли они вообще. Каннан говорит, что транспозоны часто рассматриваются как эгоистичные фрагменты ДНК, озабоченные только собственной мобильностью и сохранением.Но если носители могут «кооптировать» эти системы и перепрофилировать их, носители могут получить новые способности, как в случае с системами CRISPR, обеспечивающими адаптивный иммунитет.

IscB и TnpB, по-видимому, являются предшественниками систем Cas9 и Cas12 CRISPR. Команда подозревает, что они, наряду с IsrB, вероятно, также дали начало другим ферментам, управляемым РНК, — и они очень хотят их найти. Им любопытен диапазон функций, которые могут выполняться в природе РНК-управляемыми ферментами, говорит Каннан, и подозревают, что эволюция, вероятно, уже использовала ферменты OMEGA, такие как IscB и TnpB, для решения проблем, которые биологи стремятся решить.

«Многое из того, о чем мы думали, может уже существовать естественным образом в том или ином качестве», — говорит Алтае-Тран. «Естественные версии этих типов систем могут стать хорошей отправной точкой для адаптации к этой конкретной задаче».

Команда также заинтересована в том, чтобы проследить эволюцию систем, управляемых РНК, в далеком прошлом. «Обнаружение всех этих новых систем проливает свет на то, как развивались системы, управляемые РНК, но мы не знаем, откуда берется сама активность, управляемая РНК», — говорит Алтае-Тран.По его словам, понимание этих истоков может проложить путь к разработке еще большего количества классов программируемых инструментов.

Эта работа стала возможной при поддержке Национального научного фонда, Министерства энергетики, Национальной медицинской библиотеки, Национальных институтов здравоохранения, Медицинского института Говарда Хьюза, Открытой благотворительной организации, Благотворительного фонда Дж. Гарольда и Лейлы Мазерс, Эдварда Маллинкродта-младшего. , Фонд, Центр исследования психических расстройств Пойтраса при Массачусетском технологическом институте, Хок Э.Тан и К. Центр исследований аутизма Лизы Ян в Массачусетском технологическом институте, Центр молекулярной терапии Ян-Тан в Массачусетском технологическом институте, Лиза Ян, семья Филлипс, Р. Меткалф, а также Дж. и П.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.