Proline: Інтернет провайдер на Харківському масиві

{ «sourceCodeId»: «61001562», «sourceName»: «DIRECTSOURCECODE2», «sourceSegment»: «прямой», «profileZipcode»: «», «profileStoreId»: «», «profileStoreName»: «», «profileID»: «8506715952», «isInternational»: «ложь», «isWarrantyShippable»: «правда», «isInternationalCommerceEnabled»: «правда», «currencySymbol»: «$», «cookieLoggedIn»: ложь, «richRelevanceMode»: «рендерить», «richRelevanceApiKey»: «46baeda9936d6a41», «richRelevanceUserId»: «», «richRelevanceSessionId»: «632a48cc149e93a0d582158fbc871e8f», «rrBaseUrl»: «// рекс. richrelevance.com/rrserver/ «, «rrChannelId»: «-», «rrMobileChannelId»: «c6e0f249ecc40744», «hashedUserIdForCriteo»: «», «rrTimeout»: «10000», «isEducatorAccount»: «ложь», «sessionIsDC»: «ложь», «FullLoggedIn»: ложь, «isMobile»: «ложь», «isProp65User»: «», «JSESSIONID»: «», «enableTwoDayShipMessage»: «ложь», «enableAskUserLocation»: «ложь», «showEloyalty»: «правда», «loyaltyName»: «награды», «showLoyalty»: «правда», «loyaltyUser»: «», «loyaltyPoints»: «», «showCheckoutLoyalty»: «правда», «callCenterNumber»: «800-449-9128», «liveChat»: «ложь», «doNotSell»: «» }

Значительное усиление производства транс-4-гидрокси-1-пролина с помощью интегрированной системной инженерии в Escherichia coli

ВВЕДЕНИЕ

Гидроксипролины (Hyps) представляют собой производные l-пролина (l-Pro), гидроксилированные по C3 или C4 с различной энантиоселективностью ( 1 ). Гипс широко используется в таких областях, как биохимия, производство продуктов питания и разработка косметики ( 1 ). Гипс также активно участвует во многих вторичных метаболических путях биосинтеза различных лекарств, таких как химиотерапевтический актиномицин, противогрибковый эхинокандин, антибиотик этамицин и противовоспалительный оксацепрол ( 2 ). Trans -4-гидрокси-1-Pro (4-Hyp) является одним из наиболее широко используемых соединений Hyp.

Традиционно 4-Hyp извлекается путем кислотного гидролиза животного коллагена с использованием экологически чистых и энергоемких процессов.Альтернативный химический синтез 4-Hyp из соединений имидазола дорог и неэффективен ( 3 ). В последние годы исследователи изучили микробиологическое производство 4-Hyp. Сообщается, что специализированный класс транс- -пролил-4-гидроксилаз (P4Hs) превращает l-Pro в 4-Hyp с P4H из Dactylosporangium sp. Rh2 показывает особенно высокую активность ( 4 ). Shibasaki et al. ( 5 ) сконструировал рекомбинантный штамм Escherichia coli W1485, несущий ген Datp4h , кодирующий P4H, который продуцировал 4-Hyp в концентрации 41 г литр ^-1 за 100 часов при скармливании l-Pro.

Однако использование l-Pro в качестве корма для производства 4-Hyp неэкономично из-за его высокой стоимости (20 долларов США / кг). Многие аналоги l-Pro, такие как 3,4-d, l-дегидропролин и l-азетидин-2-карбоксилат, использовались для скрининга избыточных продуцентов l-Pro, которые лучше нарушали чувствительность обратной связи γ-глутамилкиназы в путь ( 6 ). К сожалению, некоторые из этих аналогов расщепляются l-Pro дегидрогеназой и дают ложноположительные результаты в виде штаммов с мутантами l-Pro дегидрогеназы ( 7 ).Кроме того, некоторый мутагенез и скрининг доказали, что мутанты в генах пермеаз встречаются в 100 раз чаще, чем целевые мутации, поскольку большинство аналогов l-Pro могут действовать как субстраты для транспортных систем l-Pro ( 8 ). Недавно Zheng et al. сообщил, что гены, содержащие редкие кодоны, имеют более низкие уровни транскрипции и могут страдать от недостаточной трансляции из-за нехватки соответствующих транспортных РНК (тРНК). Эти «редкие» гены могут быть использованы для трансляции более «общих» генов с более высокими уровнями транскрипции, когда в клетке недостаточно аминокислот.Это может привести к снижению или даже застою в процессе трансляции этих редких кодонов ( 9 ). Увеличение внутриклеточной концентрации аминокислот может гарантировать, что большинство тРНК остаются заряженными аминокислотами, уменьшая конкуренцию и обеспечивая нормальную трансляцию редких кодонов. Система отбора редких кодонов недавно была применена для скрининга избыточных продуцентов l-лейцина, l-аргинина и l-серина из мутантных библиотек ( 9 ).

Подобно l-изолейциндиоксигеназам (IDO), которые превращают l-изолейцин (l-Ile) в 4-гидроксиизолейцин (4-HIL), P4H являются зависимыми от α-кетоглутарата (α-KG) моноядерными негемовыми железосодержащими ферментами. Они используют α-KG и O ₂ в качестве субстратов при катализе гидроксилирования l-Pro, которое сочетается с окислением α-KG до сукцината. Следовательно, концентрация α-KG оказывает значительное влияние на гидроксилирование l-Pro. Zhang et al. сверхэкспрессировал ген α-KG дегидрогеназы (ODHC) и нокаутировал ген изоцитратлиазы aceA в E. coli , где экзогенная IDO шунтировала поток α-KG на путь продукции 4-HIL ( 10 ). Другим подходом к перенаправлению потока α-KG на 4-HIL было ингибирование ODHC.Man et al. ( 11 ) использовал вариант сайта связывания рибосомы для замены природных сайтов гена odhA в Corynebacterium crenatum для снижения активности ODHC, передавая поток углерода на путь d-аргинина. Новые синтетические малые РНК (мРНК), состоящие из РНК-шаперона и связывающих последовательностей генов-мишеней, недавно были использованы для деградации мРНК-мишени ( 12 ) с целью увеличения продукции путресцина в E. coli ( 13 ).мРНК также использовалась для регулирования уровня транскрипции odhA для снижения активности ODHC в Corynebacterium glutamicum , что привело к увеличению выхода l-глутамата ( 14 ). Однако прямое ингибирование ODHC для уменьшения потока α-KG значительно влияло на рост клеток на ранней стадии, что приводило к более длительному процессу ферментации.

Кроме того, динамическое регулирование имеет лучшую гибкость и возможность регулировки между ростом и производством, переключая перенаправление потока только в определенные ключевые моменты ( 15 ).Zhang et al. использовал биосенсор Lrp для динамического регулирования активности ODHC в C. glutamicum , что привело к превосходному выходу 4-HIL 34,21 г литр ^-1 ( 16 ). Эти результаты доказали, что продукция 4-HIL была увеличена без влияния на рост клеток на ранней стадии. Однако применение подобных биосенсоров для других путей биосинтеза в настоящее время ограничено.

В этом исследовании мы выполнили эволюцию с отбором редких кодонов ( 17 ) для улучшения продукции l-Pro из глюкозы как в E.coli и Serratia marcescens JNB5-1. Затем были применены стратегии метаболической инженерии для дальнейшего улучшения биосинтеза l-Pro. Кроме того, настраиваемая схема на основе определения кворума использовалась для динамического ослабления активности ODHC ( 18 ) для увеличения поступления α-KG путем переключения потока цикла трикарбоновой кислоты (TCA) на биосинтез 4-Hyp. Наконец, двойной мутант, полученный из esnapd2 с более высокой эффективностью каталитического преобразования за счет анализа генома и рационального дизайна, был использован для увеличения производства 4-Hyp и потребления l-Pro.В этом исследовании сообщается о новой стратегии модификации продуцента 4-Hyp, сочетающей скрининг аминокислот с метаболической инженерией и динамическим контролем ключевых ферментов в цикле TCA. Эта стратегия будет применяться в качестве общего метода модификации для получения других гидроксиламинокислот с высоким выходом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор редких кодонов l-Pro в

l-Pro имеет четыре избыточных числа, а именно CCA / CCC / CCG / CCT (Рис.1A) ( 19 ), среди которых CCC имеет самый низкий уровень использования 0,55% в E. coli . Чтобы проверить, эффективна ли система отбора на основе редких кодонов для скрининга l-Pro, 7 и 15 кодонов Pro в гене нативной устойчивости к канамицину ( kan ^R ) были заменены на CCC, давая kan ^R -H и kan ^R -A соответственно (рис. 1B). S. marcescens JNB5-1, который эндогенно превращает l-Pro в окрашенный вторичный метаболит продигиозин, также был выбран для проверки обоснованности выбора редких кодонов для l-Pro.Добавление l-Pro привело к углублению окраски культурального раствора, которую можно приблизительно охарактеризовать оптически с увеличением количества продигиозина (рис. S1A). S. marcescens JNB5-1 также обладает различной устойчивостью ко многим антибиотикам. Наконец, мы выбрали ген устойчивости к апрамицину ( apm ^R ) из S. marcescens JNB5-1 и заменили 11 и 16 кодонов l-Pro нативного гена apm ^R ( apm ^R -W) в CCA (0.27% использования в S. marcescens ), как показано на рис. 1A, что дает apm ^R -H и apm ^R -A, соответственно (рис. 1B). Все редкие гены с замещенными кодонами были клонированы в pET28a с генами kan ^R и apm ^R и затем трансформированы в E. coli BL21. Другие только с apm ^R были преобразованы в S. marcescens JNB5-1. Штаммы, культивируемые в среде M9, не показали существенной разницы в росте даже в среде 1 × Лурия-Бертани (LB).

S. marcescens

( A ) l-Pro используется в E. coli (красный ●) и S. marcescens (синий ●). ( B ) На основании различных предпочтений кодонов l-Pro в обоих штаммах 7 и 15 кодоны Pro kan ^R были заменены CCC на E. coli , давая kan ^R — H и kan ^R -A соответственно.Для S. marcescens JNB5-1 был выбран apm ^R , и 11 и 16 его кодонов l-Pro были заменены на CCA таким же образом, как kan ^R , давая apm ^R -H и apm ^R -A соответственно. Собственные кан ^R и apm ^R были названы как кан ^R -W и apm ^R -W соответственно. ( C ) Все гены в (B) были клонированы в pET28a, и полученные плазмиды были трансформированы в E.coli BL21 (серый фон) и S. marcescens JNB5-1 (белый фон), которые затем инокулировали в жидкую среду 0,2 × LB на 24 часа. В частности, канамицин использовали для отбора штаммов, несущих pET28a- kan ^R s, тогда как апрамицин использовали для отбора штаммов, несущих pET28a- apm ^R s. ( D ) Все штаммы в (C) культивировали в 0,2 × LB с l-Pro (1 г литр ^-1 ; красные линии) и 0,2 × LB без кормления с l-Pro (синие линии) в течение 24 часов. , соответственно.* P <0,05.

MP6 ^ts сначала трансформировали в E. coli BL21, получив E. coli / MP6 ^ts , которую затем культивировали в 1 × LB, содержащем 0,1 мМ арабинозу, чтобы вызвать мутацию в течение 24 часов при 30 °. С. Полученные штаммы затем культивировали при 42 ° C, чтобы гарантировать устранение MP6 ^ts , который показал ингибирование роста в среде LB с соответствующим антибиотиком. Библиотеки E. coli BL21 были превращены в компетентные клетки и трансформированы pET28a-A для отбора избыточного продуцента l-Pro. Клетки, демонстрирующие превосходный рост в 0,2 × LB (с соответствующим антибиотиком), отбирали и инокулировали в среду TY (50 мл) на 24 часа. Концентрацию l-Pro в этих культурах измеряли с помощью ВЭЖХ.

Эти штаммы затем инокулировали в ограниченную питательными веществами среду 0,2 × LB, где очевидны различия в росте как у E. coli BL21 / pET28a- kan ^R s, так и у S.marcescens JNB5-1 / pET28a- apm ^R s (рис. 1C). В E. coli BL21 / pET28a- kan ^R s, разница в OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) между E. coli BL21 / pET28a (EKW) и E. coli Штаммы BL21 / pET28a-A (EKA) были в 2,15 раза и до 4,71 раз между штаммами S. marcescens / pET28a-Wa (SW) и S. marcescens / pET28a-Aa (SA) . E. coli BL21, содержащий ген pET28a- apm ^R s, использовали для тестирования редкой частоты кодонов против антибиотиков.Различия между ними не были обнаружены, так как кодон CCA довольно часто использовался в E. coli (рис. 1C). Эти результаты показали, что скрининг редких кодонов был весьма относительным и варьировал между штаммами.

Эксперименты по воздействию аминокислот также были выполнены для проверки восстановления роста клеток путем добавления l-Pro (1 г литр ^-1 ) в среду 0,2 × LB (рис. 1D). Результаты показали, что рост E. coli BL21, несущего pET28a- apm ^R s, не изменился.Однако OD ₆₀₀ был восстановлен на 84,2% с добавлением l-Pro для EKA и был восстановлен на 150,0% в SA через 18 часов. В недавних исследованиях эффективный биосинтез l-Pro был успешно достигнут как у E. coli ( 13 ), так и у C. glutamicum ( 20 , 21 ) путем рациональной реконструкции с использованием инновационных инструментов синтетической биологии. Другие методы, такие как мультиплексная автоматизированная геномная инженерия ( 22 ), продемонстрировали преимущества в создании крупномасштабного геномного разнообразия для высокопроизводительной метаболической инженерии, хотя эффективный метод скрининга избыточных продуцентов l-Pro еще предстоит разработать.Наши результаты свидетельствуют о возможности скрининга штаммов, демонстрирующих избыточную продукцию l-Pro, с использованием метода отбора редких кодонов.

Эффект

Результаты, приведенные выше, показали, что редкий кодон l-Pro оказывает ингибирующее действие на рост клеток, замедляя трансляцию белков устойчивости к антибиотикам, хотя концентрация l-Pro эффективно ослабляет это ингибирование. Это предоставило новый метод проверки перепроизводителей l-Pro.Чтобы применить эту систему для скрининга бактерий, продуцирующих l-Pro, были использованы две плазмиды с редкими кодонами, pET28a-A и pET28a-Aa. Мутантная библиотека E. coli BL21 была приготовлена, как показано на фиг.2. Примечательно, что предыдущий репликон в плазмиде MP6 был заменен термочувствительным репликоном pSC101 ori (MP6 ^ts ), так что плазмида могла быть выделен для дальнейших исследований. MP6 ^ts трансформировали в E. coli BL21 перед индукцией мутации.После 24 часов инкубации при 30 ° C с арабинозой культуру инкубировали при 42 ° C для выделения плазмиды для создания мутантной библиотеки. Плазма атмосферной и комнатной температуры (ARTP) была использована для создания библиотеки мутаций S. marcescens JNB5-1. Обе библиотеки E. coli BL21 и S. marcescens JNB5-1 были превращены в компетентные клетки и трансформированы pET28a-A и pET28a-Aa, соответственно, для отбора избыточного продуцента l-Pro. Полученные мутанты культивировали на канамицине или апрамицине в 0.2 × LB, а затем изолировали для дальнейшего культивирования.

После 12 часов культивирования в 0,2 × LB, содержащем канамицин или апрамицин, средние значения OD ₆₀₀ для мутантов E. coli и S. marcescens JNB5-1 составляли 0,183 и 0,165 соответственно. Отобрали двадцать штаммов мутантов E. coli с наибольшим ростом, и их содержание l-Pro определяли через 24 часа во встряхиваемой колбе, содержащей среду TY. Двенадцать штаммов показали повышенную продуктивность l-Pro, среди которых штамм PM-14 достиг концентрации 0.816 г литр ^-1 (рис. 3А), что более чем в два раза превосходит дикий тип. Среди мутантов S. marcescens 31 штамм с наибольшим ростом был отобран для культивирования в среде TY для проверки выхода продигиозина во встряхиваемой колбе. Шестнадцать из них показали повышенный выход продигиозина (рис. S1B), при этом LK-18 показал урожай в 3,3 раза выше, чем у S. marcescens JNB5-1 (рис. 3B), при этом выход l-Pro увеличился на 30,2. % (Рис. 3С). Чтобы дополнительно проверить, является ли увеличение эндогенного l-Pro результатом повышенной продукции продигиозина, pigI (первая стадия превращения l-Pro в продигиозин) была отключена как в штамме дикого типа, так и в мутантном штамме LK-18. Результаты соответствовали ожиданиям: выход l-Pro был в 2,6 раза выше, чем у S. marcescens JNB5-1∆ pigI . После удаления плазмид для отбора мутантных штаммов не наблюдалось значительной разницы в росте между мутантным и диким типами как в E. coli , так и в S. marcescens JNB5-1, что указывает на то, что мутанты сохраняли определенный уровень генетической стабильности ( Рис. 3D). Хотя возможные изменения вторичной структуры мРНК были обнаружены как в генах kan ^R s и apm ^R s (рис.S2A), большинство отобранных мутантов не показали очевидных изменений транскрипции тРНК l-Pro, за исключением PM-10, PM-11 и PM-17, которые показали слегка положительную повышающую регуляцию тРНК (GGG) (рис. . S2B). Ключ к отбору редких кодонов заключался в том, что увеличение цитоплазматической концентрации целевой аминокислоты может увеличить концентрацию заряженной тРНК для эффективной экспрессии резистентных генов, что делает ее доступной для скрининга штаммов, продуцирующих избыточную аминокислоту ( 9 ). S. marcescens JNB5-1 ранее использовался для скрининга избыточных продуцентов l-Pro в качестве косвенного подтверждения достоверности отбора редких кодонов, измерения синтеза продигиозина из l-Pro ( 23 ).Кроме того, самый высокий зарегистрированный выход l-Pro (100 г литр ^-1 ) был произведен S. marcescens SP511 ( 24 ). LK-18 отличался среди мутантных штаммов селекцией редких кодонов, обеспечивая более высокий выход продигиозина, чем у штамма дикого типа, получавшего 1 г литра ^-1 l-Pro (рис. S1A). Накопленный титр l-Pro был увеличен в 2,5 раза в штамме LK-18, в котором было удалено pigI , который кодировал фермент, участвующий в пути продигиозина.В отличие от S. marcescens JNB5-1, мутированного с помощью ARTP, наша мутантная библиотека E. coli была обработана in vivo с использованием MP6 ^ts , что позволило снизить сложность библиотечной процедуры и облегчить возможность для адаптивная эволюция, чтобы сделать возможным эволюцию с помощью отбора редких кодонов.

( A ) l-Pro концентрация различных E.coli , прошедшие скрининг с помощью системы отбора редких кодонов после культивирования в ферментационной среде при 37 ° C в течение 24 часов. ( B ) Сравнение окраски между S. marcescens JNB5-1 дикого типа (WT) и мутантным LK-18, культивированным в ферментационной среде при 28 ° C в течение 8, 16 и 32 часов соответственно. ( C ) продуцирование l-Pro и продигиозина S. marcescens JNB5-1 дикого типа и мутантного LK-18, а также pigI , удаленных в соответствующих штаммах, все культивировали в среде для ферментации при 28 ° C для 12 часов.( D ) Рост S. marcescens JNB5-1 и мутанта LK-18 (сплошная линия и пунктирная линия в сочетании с квадратным узлом, соответственно), а также E. coli BL21 и его мутанта PM-14 (сплошная линия линия и пунктир в сочетании с тригональным узлом соответственно) в среде M9 с соответствующими антибиотиками.

Содействие биосинтезу l-Pro с использованием метаболической инженерии для концентрации потока углерода в l-Pro и высвобождения его ингибирования с обратной связью

Чтобы выяснить, какой этап пути биосинтеза l-Pro был ответственен за увеличение продукции l-Pro, РНК из обоих штаммы дикого типа и PM-14 экстрагировали на логарифмической фазе в 0.2 × LB среда для сравнительного анализа транскриптомов в GENEWIZ. Транскриптомика пути l-Pro между PM-14 и диким типом показана на фиг. 4A, с положительными и отрицательными значениями, представляющими повышенную и пониженную экспрессию генов пути, соответственно.

( A ) После сбора штаммов в экспоненциальной фазе в 0.2 × LB среда, анализ транскриптома Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (EMP), цикла TCA и относительного биосинтеза l-Pro или пути метаболизма в PM-14 сравнивали с таковыми для дикого типа (WT), с красным и синие кружки, представляющие положительные (активируемые гены) и отрицательные (подавленные гены) значения, соответственно, рассчитанные в считываниях на килобазу транскрипта на миллион отображенных считываний PM-14 / дикого типа (в логарифме ₂ ). ( B ) Проверка с помощью qRT-PCR ключевых генов пути биосинтеза l-Pro как PM-14, так и LK-18, с последующей концептуальной картой перепроизводства l-Pro.G6P, 6-фосфоглюкоза; F6P, 6-фосфофруктоза; FBP, 1,6-бисфосфофруктоза; GAP, 3-фосфоглицеральдегид; GBP, 1,3-дифосфоглицерат; 3GP, 3-фосфоглицерат; 2ПГ, 2-фосфоглицерат; PEP, фосфоенолпируват; PYR, пируват; AcCoA, ацетил-CoA; ОАА, оксалоацетат; ЦИТ, цитрат; Изоцитрат, Изоцитрат; AKG, α-кетоглутарат; SucCoA, сукцинил-КоА; Succ, сукцинат; Фум, фумарат; Мал, малат; Glu, l-глутамат; Pro, пролин; P5C, 1-Δ ¹ -пирролидин-5-карбоксилат.

Метаболические пути, связанные с синтезом l-Pro, включают гликолиз, цикл TCA, путь синтеза l-Pro и транспортную систему l-Pro.При анализе PM-14 было обнаружено, что гены, кодирующие гликолитические ферменты, имеют более высокие уровни экспрессии по сравнению со штаммом дикого типа, что согласуется с более высоким потреблением глюкозы PM-14. В пути TCA icd и acn , кодирующие изоцитратдегидрогеназу и аконитазу, показали значительно повышенную экспрессию, что усиливало поток в α-KG. Напротив, гены aceA и glnA показали более низкую экспрессию в мутантном штамме, что было невыгодно для накопления l-Pro.Ген proB , кодирующий фермент, ограничивающий скорость в этом пути, имел гораздо более высокий уровень экспрессии в мутантном штамме. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) была использована для проверки экспрессии четырех ключевых генов — pyk , acn , proB и glnA — в штаммах PM-14 и LK-18. . Результаты показали, что pyk , acn и proB имели повышенную экспрессию, в то время как glnA , участвующая в катаболизме l-Pro, снизилась.Экспрессия proP и putP , которая кодирует ферменты для транспортных систем l-Pro, увеличивала продукцию l-Pro в 2,3 и 3,1 раза в PM-14 соответственно. Ранее сообщалось, что PutP или ProP способствуют усвоению l-Pro во время голодания l-Pro ( 25 ). Гены proP и putP , участвующие в транспортной системе l-Pro, показали повышенную регуляцию, которая может усиливать поглощение l-Pro во время голодания l-Pro. Эти два гена участвуют в транспортировке внеклеточного l-Pro внутри клетки, и их транскрипция была усилена, особенно когда количество l-Pro в среде было недостаточным для эффективной экспрессии резистентного белка, что приводило к восстановлению роста.Однако в последующем конструировании клеток шасси l-Pro предполагается, что внутриклеточный l-Pro накапливается вне клетки, вместо того, чтобы продолжать транспортировку внеклеточного l-Pro. После выключения двух генов выход l-Pro в среде был дополнительно улучшен.

Начиная с мутанта M1, полученного из PM-14 с удаленным pET28a-A, были удалены гены proP , putP , putA и aceA для достижения максимального сохранения потока l-Pro в нижнем потоке. метаболическая инженерия (рис.4Б). Кроме того, мы ввели мутации D107N и E143A в ген proB для устранения ингибирования обратной связи (таблица S1) ( 26 ). Титр l-Pro для M1 достиг 18,2 г литр ^-1 после периодической ферментации в 7,5-литровом ферментере с ферментирующей средой, в то время как титр M6, к нашему удивлению, был в 2,06 раза выше, достигнув 37,5 г литр ^-1. (рис. S3A). Наивысшая продуцируемая концентрация l-Pro, продуцируемая штаммом M6, была сопоставима с недавно сообщенным титром у E.coli ( 13 ), что подчеркивает потенциал для промышленного масштабирования. Кроме того, M6 показал наименьшее количество побочных продуктов (рис. S3B).

Эффект динамической модуляции активности ODHC на поток α-KG к 4-Hyp

Для эффективного продуцирования 4-Hyp, Datp4h , управляемый конститутивным промотором P _tac-M , клонировали в вектор pDXW-10 и трансформировали в штамм M6R для создания штамма HYPA. Рекомбинантный штамм HYPA дал 4-Hyp в концентрации 15.7 г литра ^-1 , при этом осталось 18,1 г литра ^-1 l-Pro (таблица S2). Чтобы заставить α-KG достичь эффективного гидроксилирования, ODHC должен быть ингибирован. Однако блокирование прямого потока в цикле TCA путем выключения ODHC может влиять на рост клеток ( 27 ). Точки метаболического разветвления для α-KG были выбраны на основе гипотезы о том, что управляемый переключатель в цепи будет выгоден для производства 4-Hyp посредством динамической регулировки настройки SucA . Нативный промотор SucAB был заменен промотором P _eaS , и его транскрипция запускалась после связывания с регулятором транскрипции EsaR _I70V (кодируется esaR ) без 3-оксогексаноилгомосеринлактон (AHL). . Напротив, активная транскрипция промотора P _eaS ингибировалась постепенным накоплением внутриклеточной AHL, продуцируемой easI (кодирующей AHL-синтазу), что нарушало связывание промотора P _eaS с EsaRI70V.Различная скорость накопления AHL может подавлять промотор P _eaS в разное время для получения подходящего замедления α-KG (фиг. 5A). Следовательно, ген esaI был интегрирован для создания M6R, в котором искусственные промоторы P _bs s ( 28 ) с разной интенсивностью (сила, P _bs1

bs2

bs3

bs ) вставляли перед esaI для управления синтезом AHL с различными временными интервалами, генерируя штаммы M7-1, M7-2, M7-3 и M7-H. Чтобы проверить производительность этого переключателя на основе кворума, pDXW-10 с геном gfp _dt (прикрепленным тегом деградации на С-конце для быстрой деградации), управляемый промотором P _eaS , был трансформирован в серию M7, генерируя новые штаммы M7-1gfp, M7-2gfp, M7-3gfp и M7-Hgfp соответственно. M7-Hgfp показал самую слабую интенсивность флуоресценции, поскольку промотор P _eaS ингибировался сгенерированной AHL (фиг. 4B), что указывало на динамический контроль экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP).Чтобы регулировать активность ODHC, исходный промотор SucA был заменен на P _eaS в серии M7, давая M8-1, M8-2, M8-3 и M8-H, в которые входят pDXW-10- Datp4h впоследствии трансформировали, образуя штаммы HYPH, HYP3, HYP2 и HYP1, соответственно, с M6R / pDXW-10- Datp4h , служащими контролем, обозначенными как HYPA. Как ферментативная активность ODHC, так и qRT-PCR suA не показали снижения HYPA, в то время как ODHC в других штаммах снижалась в различной степени в зависимости от времени (рис. 4С). HYPH страдал от остановки роста из-за более высокой экспрессии easI . Хотя активность ODHC HYP2 снизилась на 31,2% через 24 часа, его биомасса осталась такой же, как у других штаммов HYPA. Янтарная кислота, образующаяся в результате гидроксилирования l-Pro, может способствовать обеспечению цикла TCA для поддержания роста. В M8-1, где нативный промотор SucA был заменен на P _eaS , но без плазмиды pDXW-10-P _eaS — Datp4h внутри, продукция l-Pro увеличилась на 14.7% по сравнению с M6R (рис. S3C). Zhang et al. ( 16 ) улучшил биосинтез 4-HIL путем переключения потока с α-KG на гидроксиламинокислоты с использованием Lrp-PbrnFE в качестве биосенсора l-изолейцина для динамического контроля активности ODHC. Точно так же для динамического регулирования активности ODHC ( 18 ) использовалась независимая от пути цепь распознавания кворума, которая имела преимущества существенного регулирования, экономичного индуктора и промышленной масштабируемости. В нашей системе esaI управляется промоторами P _bs s различной силы для контроля образования AHL, которые могут быть трансплантированы в Bacillus subtilis или Saccharomyces cerevisiae благодаря высокой совместимости P _bs s ( 28 ).

( A ) Принципиальная схема динамического регулирования ODHC на основе схемы определения кворума. Нативный промотор SucAB был заменен на промотор P _eaS , и его транскрипция запускалась при связывании с регулятором транскрипции EsaR _I70V без экспрессии AHL. Активная транскрипция промотора P _eaS будет подавляться постепенным накоплением внутриклеточных AHL, продуцируемых easI , нарушая связывание промотора P _eaS с EsaRI70V.Различные экспрессии esaI , управляемые четырьмя разными промоторами P _bs , приводили к динамическому накоплению AHL, который подавлял регуляцию промотора esaS P _{в разное время для получения подходящей модерации α-KG. Это способствовало продукции 4-Hyp Dstp4h , экзогенно клонированным в pDXW-10. ( B ) pDXW-10 с геном gfp dt , управляемым промотором P eaS , трансформировали в серию M7. Пять флуоресцентных профилей штаммов (M7s с pDXW-10-P eaS — gfp dt ) были измерены, чтобы проверить работу этого переключателя на основе кворума.а.е., единица абсорбции. ( C ) Уровень транскрипции excA и активность ODHC в HYPA, HYP1, HYP2, HYP3 и HYPH через 0, 6, 12, 18 и 24 часа соответственно. Штаммы предварительно культивировали в среде TY при 37 ° C для получения логарифмической фазы. Данные были средними значениями, полученными из трех измерений, в то время как планки ошибок показали стандартное отклонение ( n = 3).}

Эффективное производство 4-Hyp путем анализа генома и рациональный дизайн сконструированного штамма P4H

Превосходный HYP2, несущий Datp4h , достиг 43. 2 г литра ^-1 4-Hyp, что было в 2,75 раза выше, чем полученное HYPA (рис. S3D), но 4,3 г литра ^-1 l-Pro все еще оставалось. Дальнейшее продвижение активности TPH требовалось для повышения скорости конверсии l-Pro. Анализ генома был использован для эффективного майнинга P4H, потому что недостаток P4H был обнаружен и охарактеризован у микроорганизмов ( 29 ). В этом исследовании P4H в некультивируемых бактериях, кодируемый esnapd2 (E2), полученный из эволюционного дерева на основе поиска, основанного на гомологии, Sun et al. ( 29 ), был выбран для дальнейших экспериментов и показал отчетливую активность в отношении гидроксилирования l-Pro (фиг. S4A). Выравнивание карманов E2 и, как сообщается, P4H показало, что их каталитические центры были почти идентичны, за исключением L170 и P172 (рис. S4B). E2 _P172D и E2 _P172N показали увеличение активности фермента на 16,1 и 26,6% соответственно, в то время как L170A из E2 _L170A может способствовать увеличению выхода 4-Hyp в 1,38 раза по сравнению с выходом E2 _WT (рис. .S4C). Двойной мутант E2 _{L170A / P172N} увеличивал активность фермента на 27,2% и выход 4-Hyp на 42,3%. Результаты докинга показали, что замена L170A и P172N может ввести дополнительные водородные связи с субстратами (рис. 6, A и B), что может помочь стабилизировать промежуточное состояние. Кроме того, L170 был заменен на более мелкий остаток Ala, что оптимизировало канализацию субстрата (рис. S4, D и E). Для дальнейшей проверки нашей гипотезы с помощью GROMACS 2018 было выполнено моделирование молекулярной динамики (МД) белковых комплексов.4 программное обеспечение. Среднеквадратичное колебание (RMSF) 170-175 петель E2 _{L170A / P172N} было ниже, чем у E2 _WT (рис. 6E), и «устье» к карману связывания субстрата, казалось, было более вытянутые из конформационных снимков E2 _WT и E2 _{L170A / P172N} (рис. 6, C и D), соответствующих их режиму движения (рис. S4, F и G). Инструмент Rosetta Cartesian_ddg также использовался для измерения ΔΔG между ферментом и l-Pro, который показал, что E2 _{L170A / P172N} (ΔΔG = -3. 27 кДж / моль ^-1 ) способствовал стабильности комплекса фермент-лиганд (фиг. 6F).

( A и B ) Результаты стыковки (A) E2 _WT и (B) E2 _{L170A / P172N} . Графики были подготовлены с использованием профилировщика взаимодействия белков-лигандов (PLIP) ( 40 ) и инструментов Pymol. Каталитические триплеты представлены в виде красных полосок, а мутационные остатки — в виде зеленых полосок, а водородные связи, гидрофобные взаимодействия и солевые мостики показаны синими, серыми и желтыми пунктирными линиями соответственно.( C и D ) Наложенные снимки MD-траекторий (C) E2 _WT и (D) E2 _{L170A / P172N} мутантов после 30-нс MD-моделирования белковых комплексов с помощью GROMACS. (E) Различия в значениях RMSF, рассчитанных на основе моделирования методом МД, между E2 _WT и E2 _{L170A / P172N} во всех остатках. Петля, содержащая выбранные остатки, выделяется оранжевым цветом. ( F ) Rosetta использовали для расчета энергии связывания точечных мутаций.ΔΔG измеряли с помощью Cartesian_ddg инструмента Rosetta между мутантами и субстратом l-Pro.

Для дальнейшего увеличения продукции 4-Hyp, esnapd2 _{L170A / P172N} клонировали в pDXW-10 и затем трансформировали в M8-2, давая HYP2M. Периодическая ферментация HYP2M с подпиткой выполнялась в 7,5-литровом биореакторе (рис. S5). Обычно 0,8 г литра ^-1 4-Hyp было произведено за 6 часов. Конечный выход 4-Hyp достиг 54,8 г литр ^-1 , что в 1,27 раза выше, чем у HYP2.Кроме того, HYP2M показал самое низкое потребление глюкозы, что привело к максимальному выходу 0,236 г г ^-1 . Производство l-Pro в HYP2M было в конечном итоге уменьшено до конечной концентрации 0,2 г литра ^-1 за 60 часов. Park et al. ( 5 , 30 ) сообщил, что рекомбинантная E. coli с datp4h катализирует 4-Hyp с l-Pro в качестве субстрата с выходом 25 г литра ^-1 с глицерином и глюкозой (41 г литр ⁻¹ ) в качестве источников углерода соответственно.По сравнению с предыдущими результатами, наш метод производства 4-Hyp дал самый высокий урожай.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества

Все упомянутые химические вещества были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Пекин, Китай), если не указано иное. l-Pro и 4-Hyp были приобретены у Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Эндонуклеазы рестрикции были приобретены у Takara Bio Inc. (Далянь, Китай). Набор для одностадийного клонирования ClonExpress II и ДНК-полимеразы Phanta Max (p515) были приобретены у Vazyme Biotech Co.Ltd. (Нанкин, Китай). Олигонуклеотиды были синтезированы GENEWIZ Bio Inc. (Сучжоу, Китай).

Штаммы, плазмиды и среды

Штаммы и плазмиды, участвовавшие в этом исследовании, перечислены в таблице S3. Системы MP6 и CRISPR для редактирования генов были приобретены у Addgene. Были синтезированы кан ^R -H, кан ^R -A, amp ^R -H, amp ^R -A, esaI , esaR и Datp4h компании GENEWIZ Bio Inc.(Сучжоу, Китай). E. coli BL21 и S. marcescens JNB5-1 ( S. marcescens JNB5-1) культивировали в бульоне Lysogeny (LB) для конструирования вектора и 0,2 × LB для селекции. При необходимости в LB добавляли апрамицин (50 мкг мл ^-1 ), канамицин (25 мкг мл ^-1 ) или стрептомицин (50 мкг мл ^-1 ).

Конструирование плазмид и рекомбинантных штаммов

Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S4. Векторы были сконструированы путем гомологичной рекомбинации с использованием набора для одностадийного клонирования ClonExpress II и трансформированы в E.coli с помощью теплового шока или электропорации. Ген Datp4h (номер доступа ANh31194.1) и esnapd2 (номер доступа AGS49339. 1) были амплифицированы из pUC19- Datp4h и pUC19- esnapd2 с использованием Tp4h-F и Tp4h-R, а также E2-F и E2-R, которые впоследствии были клонированы в pDXW-10, образуя pDXW-10- Datp4h и pDXW-10-E2 соответственно. Точечные мутации на esnapd2 проводили с соответствующими праймерами. Подобно кан ^R -H и кан ^R -A, которые были усилены кан-1 и кан-3 из pUC19- кан ^R -H и pUC19- кан ^R -A, соответственно, apm ^R , apm ^R -H и apm ^R -A были усилены из pUC19- apm ^R , pUC19- apm ^R -H и pUC19- apm ^R -A с использованием apm-1 и apm-2 соответственно.Затем, kan ^R -H и kan ^R -A были субклонированы в векторные фрагменты, амплифицированные с помощью kan-2 и kan-4 из pET28a, тогда как apm ^R , apm ^R -H и apm ^R -A были субклонированы в векторные фрагменты, амплифицированные apm-2 и apm-4, давая pET28a-H, pET28a-A, pET28a-AW, pET28a-Ha и pET28a-Aa, соответственно. . pET28a, pET28a-H, pET28a-A, pET28a-Wa, pET28a-Ha, pET28a-Aa трансформировали в BL21 с образованием EKW, EKH, EKA, EAW, EAH и EAA соответственно.Кроме того, pET28a-Wa, pET28a-Ha и pET28a-Aa трансформировались в S. marcescens JNB5-1, генерируя SW, SH и SA, соответственно. pTargetF и pCas были использованы для редактирования генов в геноме E. coli ( 32 ), в то время как единая направляющая РНК (sgRNA) была разработана sgRNAcas9 ( 33 ). pTarget- putA , pTarget- putP , pTarget- proP , pTarget- aceA , pTarget- proB и pTarget-P _eaS — SucA были усилены PutAsg-F и PutAsg-R, PutPsg-F и PutPsg-R, ProPsg-F и ProPsg-R, AceAsg-F и AceAsg-R, ProBsg-F и ProBsg-R, а также SucAsg-F и SucAsg-R из pTarget, а затем были созданы через гомологичную рекомбинацию.Ген gfp , за которым следует тег деградации, управляемый P _eaS , был амплифицирован с использованием праймеров GFP-F и GFP-R перед рекомбинированием в pDXW-10, давая pDXW-10-P _{eaS —} gfp _dt . Затем ориджин репликации pSC101 (ori) амплифицировали из pCas с помощью MP6ts-1 и MP6ts-3 и рекомбинировали в MP6, получая термочувствительный MP6 ^ts .

Выделенный мутант E. coli PM-14 , отобранный путем отбора редких кодонов, был идентифицирован как обладающий наилучшими характеристиками в отношении биосинтеза l-Pro, штамм с pET28a-A, удаленным посредством непрерывного пассажа, был назван M1.Затем M1 / ​​pCas получали путем трансформации PM14 вектором pCas. Гомологические ветви перед и после putA амплифицировали с помощью праймеров putA-1 и putA-2, а также праймеров putA-3 и putA-4, соответственно. Их объединяли вместе с помощью перекрывающейся ПЦР для получения гомологичного плеча putA LR, который затем трансформировали в M1 / ​​pCas вместе с pTargetF- putA . После 12 часов культивирования при 30 ° C выживший положительный трансформант в LB-чашке, включающий как канамицин, так и стрептомицин, был идентифицирован с помощью ПЦР генома на делецию putA . pTargetF- putA удаляли путем добавления 0,1 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуру, тогда как pCas удаляли при культивировании при 42 ° C. Полученный стабильный штамм после трех последующих поколений был назван M2. Сходные методы были использованы для построения M3 (M2∆ putP ), M4 (M3∆ proP ), M5 (M4∆ aceA ) и M6 (M5 proB * ) с соответствующими pTargetF и праймерами. esaR I70V клонировали в локусы putP в M6, генерируя M6R. esaI , управляемый промоторами P _bs , был заменен на локусов putA , давая M7-1, M7-2, M7-3 и M7-H соответственно. Промотор excA был затем заменен на P _eaS в этих штаммах, давая M8-1, M8-2, M8-3 и M8-H, соответственно, где pDXW-10- Datp4h был окончательно трансформирован. для генерации HYP1, HYP2, HYP3 и HYPH соответственно; HYPA (M6R, несущий pDXW-10- Datp4h ) служил контролем в этой группе.Последовательности перед и после pigI ( pigI L и pigI R) были амплифицированы с помощью PigI-Delete-Up-F и PigI-Delete-Up-R, а также PigI-Delete-Down-F и PigI- Delete-Down-R, прежде чем они были объединены с apm ^R посредством перекрывающейся ПЦР. Полученный в результате pigI L- apm ^R — pigI R был впоследствии субклонирован в pUTmini Tn5-Km, давая pXW1805. pXW1805 трансформировали в E. coli S17-1, получив E.coli S17-1 / pXW1805, который скрещивался с S. marcescens JNB5-1 для делеции pigI . По такому же методу был построен LK-18∆ pigI .

Скрининг избыточных продуцентов l-Pro из библиотек мутаций

Система мутаций ARTP (Beijing Bestsqy Biotechnology Co. Ltd.) была использована для создания библиотек мутаций S. marcescens JNB5-1, так как это привело к большему повреждению генома, чем традиционные ультрафиолетовый мутагенез ( 34 ).Гелий высокой чистоты разряжался в высокочастотном электрическом поле для генерации плазмы, которая вызывала разнообразные повреждения структуры ДНК и активировала SOS-репарацию в клетках, создавая множество участков несовпадения в геноме. S. marcescens JNB5-1 дикого типа, выращенный до OD ₆₀₀ при 0,2-0,4 в 1 × LB, был выбран для обработки ARTP со скоростью 10 стандартных литров в минуту и ​​100 Вт. Ранее было добавлено 10 мкл культуры. на слайды, а затем подвергались воздействию струи ARTP в течение 10, 20 и 30 с, со смертельным исходом 86.5, 96,1 и 99,3% соответственно. Для приготовления мутантных библиотек S. marcescens JNB5-1 штаммы дикого типа, обработанные ARTP в течение не менее 10 с, промывали в 1,5-мл стерилизованных пробирках Эппендорфа, содержащих 800 мкл среды LB, и инкубировали при 37 ° C в течение 1-2 часа, генерируя библиотеки мутаций S. marcescens JNB5-1. Для получения библиотек мутантов E. coli , MP6 ^ts был предварительно трансформирован в E. coli BL21 для получения E.coli / MP6 ^TS . E. coli / MP6 ^ts затем культивировали в LB при 30 ° C с 0,1 мМ арабинозы для индукции мутации в течение 24 часов. Затем штамм культивировали при 42 ° C для удаления MP6 ^ts . Полученная культура гарантированно не содержала MP6 ^ts , что показало ингибирование роста в среде LB плюс соответствующий антибиотик. Обе библиотеки S. marcescens JNB5-1 и E. coli BL21 были превращены в компетентные клетки и трансформированы векторами pET28a-Aa и pET28a-A для отбора избыточного продуцента l-Pro соответственно.Клетки, демонстрирующие превосходный рост в 0,2 × LB (с соответствующим антибиотиком), отбирали и инокулировали в 50 мл среды TY на 24 часа. Концентрацию l-Pro в этих культурах измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Ферментация

Для культивирования в колбах клетки, хранящиеся путем замораживания при -80 ° C, культивировали в LB для активации при 37 ° C и 210 об / мин в течение ночи с 25 мкг мл ^-1 канамицина. Затем культуру (0,5 мл) переносили в колбу на 500 мл, содержащую 50 мл среды TY.Для дальнейшей периодической ферментации с подпиткой культуру (OD ₆₀₀ , от 3 до 8) инокулировали в 7,5-литровый биореактор, содержащий 3 литра ферментационной среды: дрожжевой экстракт (8 г, литр ^-1 ), пептон ( 12 г литр ^-1 ), NaCl (3 г литр ^-1 ), лимонная кислота (2,1 г литр ^-1 ), (NH ₄ ) ₂ SO ₄ (2,5 г литр ^-1 ) и глюкозы (20 г литр ^-1 ), подача 15 мл раствора следов металлов: FeSO ₄ · 7H ₂ O (10 г литр ^-1 ), ZnSO ₄ · 7H ₂ O (1 г литр ^-1 ), CoCl ₂ · 6H ₂ O (2. 5 г литр ^-1 ), MnCl ₂ · 4H ₂ O (15 г литр ^-1 ), CuCl ₂ · 2H ₂ O (1,5 г литр ^-1 ) и H ₃ BO ₃ (3 г литр ^-1 ). Культуру с исходной OD ₆₀₀ менее 0,3 ферментировали при pH 7,0, 37 ° C и 2,0 литрах мин ^-1 воздушного потока. Уровень растворенного кислорода поддерживался на уровне 40% за счет автоматического регулирования скорости перемешивания от 600 до 1000 об / мин.PH регулировали добавлением 30% (wv ^-1 ) NH ₃ · H ₂ О. Глюкоза [80% (wv ^-1 )] добавлялась для поддержания низкой остаточной концентрации 10 г литр ⁻¹ .

Анализ транскриптома

E. coli BL21 и PM-14 собирали при выращивании до OD ₆₀₀ 0,8, а затем собирали замораживанием осадка в жидком азоте перед доставкой в ​​сухом льду в Vazyme Biotech Co. (Нанкин, Китай) для анализа транскриптома.Затем из целевых штаммов экстрагировали РНК, а внутреннюю рРНК внутри удаляли с помощью набора Ribo-Zero Kit. Очищенную обедненную рибосомами РНК фрагментировали и использовали в качестве матрицы для синтеза комплементарной ДНК (кДНК), которую впоследствии подвергали репарации концов, добавлению аденина и лигированию адаптера для амплификации ПЦР. Полученные библиотеки кДНК секвенировали с использованием секвенатора Illumina HiSeq 2000 с эталонным геномом E. coli BL21 (GenBank ID: AM946981.2). В общей сложности 10 146 936 считываний соответствовали указанному геному дикого типа, а 9 330 264 считывания соответствовали PM-14.Дифференциально экспрессируемые гены определяли с использованием стандартов частоты ложного обнаружения ≤0,001, кратность изменения | log ₂ ratio | ≥1 между диким типом и PM-14.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Оба мутанта PM-14 и LK-18, а также их дикие типы были собраны в их логарифмических фазах. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции бактериальной РНК. После обратной транскрипции с использованием HiScript III RT SuperMix для кПЦР (+ протирочная машина гДНК), выбранные РНК были амплифицированы с использованием AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix с указанными праймерами (таблица S4), используя 16 S рРНК в качестве внутреннего контроля в системе StepOnePlus , с обнаружением SYBR Green I. КПЦР выполняли с начальной денатурацией при 95 ° C в течение 5 минут, затем 40 циклов по 10 с при 95 ° C и 30 с при 60 ° C. Анализ кривой плавления проводили в течение 15 с при 95 ° C, 60 с при 60 ° C и 15 с при 95 ° C. Продукты ПЦР образцов целевого гена измеряли в трех повторностях. Данные анализировали по методу 2 ^{−∆∆ C T} ( 35 ). Аналогичный метод был использован для анализа qRT-PCR тРНК l-Pro, которые были ранее деацилированы, как описано ( 36 ), с 5 S рРНК в качестве внутреннего контроля.

Ферментный анализ

Неочищенные клеточные экстракты использовали для измерения вовлеченных ферментов. Клетки, культивированные в течение 24 часов, собирали центрифугированием при 4 ° C и 10000 об / мин в течение 10 минут. Затем их дважды промывали трис-HCl буфером (0,1 М, pH 7,0) перед обработкой ультразвуком в течение 15 минут на льду, после чего обработанную ультразвуком смесь центрифугировали при 10000 об / мин в течение 30 минут при 4 ° C для удаления остатков клеток. Супернатант фильтровали и использовали для анализа активности фермента. Для определения активности TP4H, 0.1 мл неочищенного экстракта добавляли в реакционную смесь, состоящую из 20 мМ l-Pro, 20 мМ α-KG, 1 мМ FeSO ₄ · 7 H ₂ O, а также 5 мМ аскорбиновой кислоты в буфере Hepes ( 50 мМ, pH 7,0) при 30 ° C в течение 30 мин. Для обнаружения 4-Hyp после реакции использовали ВЭЖХ. Для оценки активности ODHC из клеток HYPA, HYP1, HYP2, HYP3 и HYPH брали пробы через 0, 6, 12, 18 и 24 часа во время ферментации соответственно. Активность ODHC в 0,1 мл этих экстрактов оценивали описанным ранее методом ( 37 ), измеряя начальную скорость абсорбции NADH (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида) при длине волны 365 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (Biotek Instruments Inc., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Концентрацию белка в неочищенном экстракте определяли методом Брэдфорда, используя бычий сывороточный альбумин в качестве контроля.

Аналитическая процедура

Клетки-мишени инокулировали в TY и / или ферментационную среду до конца ферментации. Культуру центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 минут и соответствующим образом разбавляли перед обнаружением общей продукции l-Pro, секретируемой в культуральной среде, а также других аминокислот. Ферментный супернатант измеряли предколоночной дериватизацией.Вкратце, 200 мкл супернатанта образца были должным образом разбавлены перед смешиванием со 100 мкл фенилизотиоцианата (1,25% об. / Об.) И 100 мкл триэтиламина (14% об. ^-1 ), растворенных в ацетонитриле в течение 1-2 часов. После дериватизации к смеси добавляли 400 мкл n -гексана, из которой нижнюю водную фазу сливали в колонку с октадецилсиланом с 5 мкм Platisil размером 250 × 4,6 мм. Образцы были градиентно элюированы подвижной фазой A [46,3 мМ ацетат натрия и 7% ацетонитрил (pH 6.5)] и подвижной фазы B (80% ацетонитрила по объему ^-1 ) с 1 мл мин ^-1 следующим образом: от 0 до 2 минут, A 100%; От 2 до 15 мин, от 100 до 88%; От 15 до 25 мин, от 88 до 70%; От 25 до 32 мин, от 70 до 50%; От 32 до 33 мин, от 50 до 0%; От 33 до 38 мин, от 0 до 100%. Аминокислоты были обнаружены путем измерения поглощения ультрафиолета при 254 нм.

Моделирование и анализ структуры

Сервер распознавания протеиновых складок (Phyre2) (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) использовался для прогнозирования модель трехмерной структуры ( 38 ).Все МД-моделирование проводилось с использованием GROMACS версии 2018.1 с силовым полем AMBER. Ферменты помещали в периодические додекаэдры с набивкой 12 Å, заполненной переносимым межмолекулярным потенциалом с 3 точками (TIP3P) воды. После минимизации энергии наискорейшего спуска моделирование канонического ансамбля (NVT) продолжалось 2 нс при 298 K с шагом 2 фс. В конце концов, моделирование продолжалось 30 нс при 298 K с шагом 2 фс. Cartesian_ddg, полученный из Rosetta, использовали для расчета ΔΔG между ферментом и продуктом ( 39 ).

Статистический анализ

Каждый эксперимент проводился как минимум дважды, независимо друг от друга как минимум в трех биологических повторах. Полоса ошибок представляет собой SEM, вычисленную функцией СТАНДОТКЛОН в Microsoft Excel. Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism 5.0, и статистическая значимость была установлена ​​на уровне P <0,05.

Благодарности: Финансирование: Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2018YFA0

0) и Национальным фондом естественных наук Китая (31870066), проект финансируется Китайским фондом постдокторантуры (2016 T) , Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов (JUSRP51708A), проект, финансируемый Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу, проект 111 (111-2-06), Национальная программа первоклассных дисциплин в области технологий и инженерии легкой промышленности (LITE2018-06), Программа ключевых исследований и разработок автономного района Нинся-Хуэй (2019BCH01002), программа промышленного развития «Центр совместных инноваций для современного промышленного брожения» провинции Цзянсу и создание группы научно-технических инноваций автономного района Нинся-Хуэй (KJT2017001 ). Вклад авторов: M.L., M.X. и Z.R. задумал и разработал эксперименты. M.L., Z.M. и X.P. выполнил построение штаммов. J.Y., M.H. и Y.S. выполнили ферментацию l-Pro и 4-Hyp. М.Л. выполнил моделирование MD, а также вычисления Rosetta. T.Y. и X.Z. проанализировали данные. М.Л. написал газету. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в статье и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Home — Детское оборудование ProLine ™

^Pro _Line ™ — Детское оборудование для питомника и профессионального ландшафтного дизайна

ProLine ™ повышает производительность за счет эффективных и экономичных решений для садоводов и специалистов по ландшафтному дизайну. Более чем двадцатипятилетний опыт работы в сфере питомниководства в качестве владельцев и операторов Heritage Oak Farm, первоначально расположенной в самом сердце Индианы, научил нас важности использования правильного оборудования.Имея опыт в производстве широкого ассортимента высококачественных вечнозеленых хвойных растений премиум-класса для питомников, садовых центров, застройщиков и профессиональных ландшафтных дизайнеров, мы понимаем, что необходимо в питомниках и ландшафтном оборудовании.

Мы начали проектировать, проектировать и строить собственное оборудование для перемещения и посадки деревьев после того, как поняли, чего не хватает на рынке. Наши клиенты вскоре начали просить нас сделать для них такое же оборудование. Так началась серия оборудования для питомников ProLine ™, созданная специалистами по уходу за питомниками и садоводом.

ProLine ™ зарекомендовало себя там, где оно имеет значение. Мы продолжаем полевые испытания и дорабатываем каждую единицу оборудования, чтобы гарантировать максимальное качество и производительность. Только оборудование, работающее безопасно, эффективно, надежно и рентабельно, заслуживает торговой марки ProLine ™.

Оборудование для перевозки деревьев

Оборудование для рассадки деревьев и посадки деревьев — наша специальность, разработанная опытным питомником с образованием и экспертными знаниями в области машиностроения.Наше оборудование спроектировано на основе фактического практического опыта и спроектировано с учетом конкретных потребностей наших клиентов. Мы приглашаем вас сравнить нашу линейку продуктов с другими продуктами на рынке. Мы уверены, что вы найдете лучшее доступное оборудование для питомников.

Наше эффективное и экономичное оборудование для перемещения и посадки деревьев включает:

ProLine ™ GRABBER ™
GRABBERMINI ™
Swingin ’GRABBER ™
ProLine ™ Вилы
ProLine ™ Погрузчик для горшков
ProLine ™ Tree Tyer
ProLine ™ Вилы для горшков
ProLine ™ ЛОПАТА
ProLine ™ Tree Auger
™
™ Auger

Каждый продукт ProLine ™ для питомников и ландшафтного дизайна разработан с учетом минимальных требований к техническому обслуживанию. Вы можете рассчитывать на такую ​​стойкость, которая выдержит агрессивную среду коммерческих питомников и ландшафтных работ. Основой для каждого продукта, который мы разрабатываем, является выполнение работы быстрее, проще и безопаснее с меньшими трудозатратами и без повреждения растительного материала.

ProDuctivity — вот что такое ProLine ™! Вы можете быть уверены в нашем многолетнем опыте и практическом опыте, индивидуальном проектировании и разработке оборудования для перемещения и посадки деревьев. Свяжитесь с нами, чтобы узнать, как улучшить работу вашего питомника или ландшафта с помощью специально разработанного оборудования для питомников.

Линия продуктов

— Линия продуктов ProLine Plus

— ProLine Plus — Подсказки

Продолжая наше наследие профессиональных телесуфлеров, новый член нашей линейки телесуфлеров ProLine является самым универсальным телесуфлером на рынке. Установка без инструментов за несколько минут и быстрый переход от крепления на салазках к свободной стойке или креплению на рейке.

Разбивается и упаковывается в половину размера нашей стандартной серии ProLine для более компактного хранения и транспортировки без потери долговечности или качества, которые были стандартом для нашей серии ProLine.

Узнайте о функциях Proline Plus ниже или просто начните делать покупки. Разработан и собран в США из первоклассного светоделительного стекла американского производства.

Переключение между SLed Mount и Free Stand

Создано для профессионалов

ProLine Plus против Flex Plus

Телесуфлеры

ProLine Plus гораздо более адаптируемы, чем любые другие телесуфлеры на рынке.Функция подъема и опускания, а также возможность наклона стекла являются основным преимуществом нашей серии ProLine Plus. У суфлеров ProLine Plus и Flex Plus есть складывающийся капюшон, который вдвое меньше их оригинальных версий. Оба могут работать с мониторами любого размера, от iPad до 24 дюймов, но когда цена вызывает беспокойство, серия Flex Plus может быть вашим лучшим выбором в телесуфлере.

Мониторы заднего хода

Самореверсивные мониторы переворачивают текст, чтобы его можно было прочитать на стекле телесуфлера.Нереверсивные (стандартные) мониторы требуют сложных действий для переворота текста в программном обеспечении. В компании Prompter People все или наши телесуфлеры поставляются с реверсивным монитором — функцией, которой нет у большинства других телесуфлеров в этой отрасли. Это экономит время и деньги при любой съемке и позволяет использовать подсказки с помощью текста или PowerPoint. Все телесуфлеры на базе монитора поставляются с бесплатной копией программного обеспечения Flip-Q

.

Переменная высота / угол

Одним из основных преимуществ телесуфлеров серии ProLine Plus является легко регулируемая высота и угол светоделителя.Поднять или опустить стекло, а также изменить угол наклона стекла для идеального просмотра можно быстро и легко. Съемщики локации оценят возможность подстраиваться под любую съемочную ситуацию или камеру.

От iPad до 24-дюймовых мониторов

Телесуфлеры серии ProLine Plus обеспечивают полную гибкость. От недорогих и простых в использовании систем iPad до самых больших, удобных для чтения 24-дюймовых мониторов.Какой из них соответствует вашим потребностям, мы сразу же отправим вам. Каждый размер монитора соответствует определенному размеру стекла для использования на расстоянии от 5 до 30 футов. Используйте эту таблицу для облегчения выбора.

Стекло трапециевидной формы

Trapezoidal, или Studio Glass, был специально разработан и долгие годы использовался в телевизионном производстве. Наклон стекла наружу позволяет увеличить угол обзора, не создавая проблем, связанных с «падением».Когда якоря или громкоговорители переключаются с одной камеры на другую, трапециевидное стекло позволяет видеть вне оси для нескольких талантов. В Prompter People всегда стремятся сделать лучший продукт для нужного пользователя.

60/40 Стекло лучше

Вся цель телесуфлера состоит в том, чтобы диктор или зритель могли легко читать текст. Чисто, ясно и ЯРКО.Стекло 60/40 будет отражать 40% изображения монитора обратно зрителю. Обеспечивает более четкое, чистое, ЯРКОЕ, легко читаемое изображение. Другие телесуфлёры будут отражать только 30% изображения, поэтому зрителю может быть труднее читать текст. На наш взгляд, компании, которые говорят, что стекло 70/30 лучше, просто ошибаются. Однако, если вы запросите стекло 70/30, мы можем предоставить его вам.

Монитор высокой яркости

Мониторы

High Bright — ценная опция в любом приложении, где требуется максимальная яркость и удобочитаемость с телесуфлера.Обычно используется на открытом воздухе или в ярко освещенных студиях или аудиториях. Наши мониторы High Bright кажутся глазам вдвое ярче по сравнению со стандартными мониторами. Компания Prompter People предлагает обновление для монитора High Bright по доступной цене, дополнительно 200 долларов за 12-дюймовый монитор и 400 долларов за любой другой размер.

Обратите внимание, что на изображении слева представлено изображение высокой яркости. Это показывает, как выглядят наши мониторы на 1000 нит по сравнению со стандартным монитором на 400 нит. Наши стандартные мониторы хорошо видны в нормальных условиях в помещении, но мониторы с высокой яркостью дают дополнительную яркость, не влияя на изображение, передаваемое на камеру через светоделитель.

Сани съемные

Преобразовать или сломать ProLine Plus невероятно просто. Благодаря съемным салазкам переходите от автономной к снегоходу за считанные минуты. Благодаря тому, что он вдвое меньше прежнего телесуфлера ProLine, это помогает ProLine Plus не только быть многоцелевым телесуфлером, но также позволяет превратить его в более компактную версию для хранения и транспортировки.

Комплекты для отдельно стоящего и RailMount

Есть определенные моменты / производства, когда вам нужно, чтобы ваш телесуфлер был установлен на стойке, отдельной от штатива камеры, или был подключен через направляющие 15 или 19 мм. Все модели Flex Plus и ProLine Plus легко переключаются на автономный или устанавливаемый на рельс телесуфлер с помощью простых наборов для переоборудования без использования инструментов. Их можно добавить при оформлении заказа или приобрести позже, когда они вам понадобятся.По сути, это дает вам 3 телесуфлера в одном.

Простая сборка

Нет необходимости разбивать набор инструментов или планировать час настройки. Никаких инструментов не требуется. Нет сложных инструкций по установке системы стекла и направляющих. Мы сделали наши суфлеры максимально простыми и прочными в использовании. Так вы сможете сосредоточиться на текущей задаче.

Доставка и возврат

На отправку может повлиять COVID-19

Загрузка, пожалуйста подождите. ..

Преимущества аминокислоты пролина

| Livestrong.com

Пролин — важная заменимая аминокислота.

Пролин, также известный как L-пролин, представляет собой аминокислоту.Это несущественно, потому что он может быть синтезирован организмом при расщеплении L-глутамата, другой аминокислоты. Белок расщепляется на аминокислоты или строительные блоки. Если вы потребляете достаточное количество белка в своем рационе, ваше тело будет иметь необходимое количество аминокислот, необходимое для выработки пролина, важного соединения, отвечающего за восстановление тканей, образование коллагена, профилактику артериосклероза и поддержание артериального давления.

Образование коллагена

Коллаген — это гладкая и гибкая ткань, которая покрывает и скрепляет кости, как клей.Это основной структурный белок, обнаруженный во всем организме. Он действует как амортизатор и снижает трение. Помогает заживить хрящи и смягчить суставы. Пролин помогает организму расщеплять белки для использования в здоровых клетках. В сочетании с лизином, другой аминокислотой, пролин является предшественником гидроксипролина и гидроксилизина. Организм использует гидроксипролин для образования коллагена, сухожилий, связок и сердечной мышцы. Коллаген содержит примерно 15 процентов пролина. По этой причине адекватный пролин полезен для лечения таких состояний, как остеоартрит, растяжения мягких тканей и хроническая боль в спине.

Профилактика артериосклероза

Пролин играет важную роль в борьбе с артериосклерозом или укреплением артерий. Основная причина сердечных заболеваний, артериосклероз, возникает, когда кровеносные сосуды или артерии, которые переносят кислород и питательные вещества от сердца к остальной части вашего тела, становятся толстыми и жесткими из-за накопления жира на стенках артерий. Это предотвращает расширение и сокращение артерии при биении сердца и может ограничить приток крови к вашим органам и тканям.Пролин позволяет стенкам выводить накопившийся жир в кровоток, уменьшая размер закупорки сердца и окружающих сосудов. Таким образом, пролин снижает давление, создаваемое этими блокировками, что снижает риск сердечных заболеваний.

Здоровая кожа

Кожа — это самый большой орган тела, а также первая иммунная защита от инфекции. Гидроксипролин производит коллаген, важный компонент кожной ткани. Молодая кожа имеет тенденцию быть более эластичной и толстой, тогда как стареющая кожа становится тонкой и менее волокнистой, поскольку количество коллагена уменьшается и изменяется эластичность элементов.Процесс старения, помимо воздействия солнца и повреждения свободными радикалами, приводит к тому, что кожа становится более старой, морщинистой и менее гладкой. Пролин увеличивает выработку коллагена и предотвращает его потерю. Он также улучшает текстуру кожи и способствует образованию новых клеток.

Ремонт тканей

Производство пролина увеличивается во время травм мягких тканей, травм и заживлений ран, таких как восстановление мышц или сухожилий, тяжелых ожогов и после операций. Пролин — важное соединение в медицинских повязках, которые используют фрагменты коллагена для стимуляции заживления ран.Недостаток пролина в организме может быть причиной деформаций или разрывов мягких тканей и более медленного, чем обычно, заживления. Следовательно, после травмы мягких тканей вы можете захотеть добавить пролин, чтобы обеспечить адекватное производство коллагена и достаточное заживление ран.

Робин ProLine

Характеристики

Камера
ProLine с поддержкой HomeKit поставляется с 5-мегапиксельной видеокамерой с разрешением HD (720p). Объектив камеры — широкоугольный с углом обзора 130 градусов (диагональ).Камера защищена куполом из закаленного оптического стекла с фотохроматическими свойствами.

Защищенное видео HomeKit
ProLine поддерживает безопасную запись видео HomeKit.

Корпус
Передняя панель изготовлена ​​из анодированного алюминия (3 мм) со светлой матовой отделкой. Блок опционально поставляется с коробкой для поверхностного монтажа (тип A03001) или для установки в бетонную или каменную стену можно использовать коробку для скрытого монтажа с возможностью настройки (тип A01112).

Кнопки
Кнопка вызова на основе пьезотехнологии (нажатие вместо нажатия) с подсветкой.

Реле
Дверной звонок ProLine можно подключить к существующему звонку с помощью встроенного релейного контакта, чтобы вы всегда могли слышать звонок, даже если iPhone или iPad в режиме «Не беспокоить»

Источник питания
Дверной звонок Robin Proline получает питание через «Power-over-Ethernet».

Технические характеристики

Номер детали	Робин ProLine A01511
Размеры	110 мм (ширина) x 257 мм (в) x 45 мм (глубина)
Камера	5-мегапиксельная IP-камера Широкоугольный объектив 130 градусов
Разрешение	HD-видео (720p)
Подключение	Проводной Ethernet
Реле	1 встроенное сухое реле, нормально разомкнутый, макс. 48 В / 60 Вт
Защита от проникновения	IP53
Мощность	Питание через Ethernet (PoE IEEE 802.3af)
Передняя панель	Анодированный алюминий (3 мм) с матовым покрытием. Купол из закаленного оптического стекла с фотохроматическими свойствами для защиты линзы. Клавиши с гравировкой и светодиодной подсветкой. Передняя панель с нанопокрытием для дополнительной защиты от ультрафиолета.
Гарантия	48 месяцев (DDP с ручной кладью)
Безопасная запись видео HomeKit	HomeKit Secure Video позволяет безопасно хранить активность, обнаруженную вашими камерами, в iCloud.Apple TV, HomePod или iPad, работающие в качестве домашнего концентратора, интеллектуально определяют, когда человек, животное или транспортное средство находится на видео, записанном вашим видеодомофоном ProLine, перед тем, как безопасно сохранить его в iCloud.
Совместимость

Защищенное видео HomeKit

HomeKit Secure Video позволяет вам безопасно хранить в iCloud действия, обнаруженные вашим видеодомофоном ProLine.

Запечатлейте важных событий в вашем доме и вокруг него.Apple TV, HomePod или iPad, работающие в качестве домашнего концентратора, интеллектуально определяют, когда человек, животное или транспортное средство находится на видео, записанном вашим видеодомофоном ProLine, перед тем, как безопасно сохранить его в iCloud.

Уведомления: получать расширенные уведомления на свой iPhone или iPad и воспроизводить видеоклипы прямо с экрана блокировки при записи активности. Вы также можете поделиться своим приложением Home с другими, чтобы они тоже могли просматривать видеозаписи.

Конфиденциальность: выберите, когда ваш видеодомофон ProLine может транслировать и записывать видео с помощью HomeKit. В приложении Apple Home настройте ProLine на автоматическую трансляцию и запись активности, когда вас и других нет дома, и выключение, когда вы дома.

Безопасность: видеопоток, передаваемый с ProLine и iCloud, зашифрован на ваших устройствах, поэтому только вы и люди, с которыми вы делитесь своим приложением Apple Home, можете просматривать его.

iCloud: 10-дневная история записи с ProLine надежно хранится в iCloud и доступна для просмотра в приложении Apple Home на вашем iPhone, iPad или Mac.Вы можете добавить одну камеру в свой тарифный план на 200 ГБ или до пяти камер в план на 2 ТБ без дополнительных затрат. Записи с камеры не учитываются при ограничении вашего хранилища iCloud.

Обнаружение движения можно использовать для запуска HomeKit Secure Video, чтобы определить, когда человек, животное или транспортное средство находится в записанном видео, прежде чем безопасно сохранить его в iCloud. И его также можно использовать для запуска автоматизации, например, для включения света у входной двери при обнаружении движения.

HomeKit Secure Video требует поддерживаемого плана iCloud и HomePod с iOS 13.2 или новее, Apple TV с tvOS 13.2 или новее или iPad с iPadOS 13.2 или новее, настроенным в качестве домашнего концентратора.

Видео

Гравировка

Пролин Вы можете заказать одну или несколько гравировальных этикеток для новых и существующих устройств.Размеры таблички адаптированы к соответствующему устройству внутренней связи.

ПЗС-камеры с охлаждением FLI ProLine

---

ProLine устанавливает стандарты в таких ключевых областях производительности, как скорость загрузки, охлаждение, низкий уровень шума, технология защиты от ореолов, качество изображения и линейность.

1. Датчик Охлаждение до 70 ° C ниже температуры окружающей среды (воздушное охлаждение)
2. ПЗС большого формата до 50 мм x 50 мм
3. Межстрочный сенсор, работа на 12 МГц (16 бит)
4. Полнокадровый сенсор, работа до 14 МГц (16 бит)
5. Отдельный встроенный A2D для минимального шума (1 МГц)
6. Отличная линейность
7. Выбор окон — Просмотр кривых пропускания
8. Основание с жидкостным или воздушным охлаждением
9. Стандарт технологии защиты от привидений RBI
10. достигает рабочих температур за 5 минут!


11. ON Semi объявил об окончании срока службы всех ПЗС-матриц.
12. Последний день для размещения заказов на датчики был 18 марта 2020 г.
13. Ссылки на спецификации для моделей, снятых с производства, перечислены здесь.
14. FLI имеет запас ПЗС-матриц KAF-16803.

• Изображения
• Задняя подсветка
• Рисунки ProLine
• Датчики

ProLine со стандартным ласточкиным хвостом

ProLine с кругами под болт M4

ProLine с линзой Linos

Сверхновая SN2012fr в NGC 1365 в Fornax:
Сверхновая SN2012fr, обнаруженная Аленом Клотцем с помощью телескопа ТАРО в Ла-Силла 27 октября 2012 года, вспыхнула в красивой южной спиральной галактике NGC 1365 в созвездии Форнакса. На этом изображении Майка Сидонио, сделанном 11 ноября 2012 года с помощью ProLine16803 на астрографе Orion Optics AG12, расположенном в Австралии, можно увидеть все еще яркую сверхновую, ярко сияющую рядом с ядром галактики.

{@model} Характеристики датчика
Датчик:	{sensor / @ sensor_manufacturer} {sensor / @ model}
Пикселей:	{sensor / @ array_size}
Размер пикселя:	{sensor / @ pixel_size}
Емкость полной скважины:	{sensor / @ linear_full_well}
Диагональ сенсора:	{sensor / @ sensor_diagonal} мм
Размер видео (дюйм):	{sensor / @ video_size}
Антиблуминг:	{sensor / @ anti_blooming}
Варианты цвета:	{сенсор / @ color_monochrome}
Тип ПЗС:	{sensor / @ sensor_type}
Классы ПЗС:	{sensor / @ grades_available}
{@model} Performance Camera Spec Sheet:
Статус:	{@status}
Скорость оцифровки:	{@digitization_speed}
Типичный системный шум:	{@typical_system_noise}
Типичное максимальное охлаждение:	{@typical_minimum_cooling}
Типичный темновой ток:	{sensor / @ typing_dark_current}
Нелинейность:	{@nonlinearity}
Крепления объектива:	{@mount}
Доступные жалюзи:	{@available_shutters}
Все камеры ProLine
Размеры корпуса:	{@dimensions}
От фокальной плоскости до лицевой панели:	{@focal_plane_to_faceplate}
Вес:	{@weight}
Интерфейс:	{@interface}
Температурная стабильность:	{@tempera_stability}
Удаленный запуск:	{@remote_triggering}
Наработка на отказ затвора:	{@shutter_mtfb}
Мощность:	{@power}
Окружающая среда:	{@operating_environment}
{@note}
Абсолютная квантовая эффективность

На некоторых рисунках показаны физические размеры, а на других — оптические. Пожалуйста, проверьте раздел примечаний на чертеже.

ProLine 65 мм Затвор с воздушным охлаждением PDF (152 КБ)	ProLine 65 мм Затвор с жидкостным охлаждением PDF (88 КБ)	ProLine 90 мм Затвор с воздушным охлаждением PDF (72 КБ)
	ProLine с кругами под болт M4 PDF (191 КБ)

Доступные датчики

.

No related posts.